羟基红花黄色素A抑制脑组织蛋白质硝基化的体外研究

赵瑞杰， 孙 莉， 刘星苗， 梁 浩， 赵丽辉， 程 焱

羟基红花黄色素A抑制脑组织蛋白质硝基化的体外研究

赵瑞杰1， 孙 莉2， 刘星苗2， 梁 浩2， 赵丽辉1， 程 焱2

目的 研究羟基红花黄色素A(HSYA)对体外亚铁血红素/亚硝酸钠/过氧化氢(heme/NaNO2/ H2O2)途径引起脑组织蛋白质硝基化的抑制作用。方法 模拟体内heme/NaNO2/H2O2硝基化途径，分别以牛血清白蛋白和脑组织蛋白为硝基化底物，分为对照组及药物干预组，HSYA的终浓度依次为0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L。以Western blotting法检测蛋白质酪氨酸硝基化水平。结果 Heme/NaNO2/H2O2途径可引起牛血清白蛋白和脑组织蛋白显著的硝基化修饰，加入不同浓度HSYA后，蛋白质硝基化水平均呈剂量依赖性地降低，其中以1mmol/L HSYA的抑制作用最明显，与对照组相比，差异具有统计学意义(P均＜0.05)。结论 HSYA可剂量依赖性地抑制heme/NaNO2/H2O2途径在体外对脑组织蛋白的硝基化修饰;提示HSYA抑制蛋白质硝基化反应可能是其对抗脑血管疾病与神经系统变性疾病的分子机制之一。

羟基红花黄色素A;亚铁血红素;蛋白质硝基化

氧化应激状态下，机体内氧化系统与抗氧化防御系统的平衡遭到破坏，体内生成过多的高活性分子如活性氧自由基(reactire oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)会导致氨基酸残基氧化修饰及改变蛋白质的结构与功能，引起组织损伤。3－硝基酪氨酸(3－nitrotyrosine，3－NT)作为RNS攻击蛋白质酪氨酸的产物，它的产生被认为是体内蛋白质硝基化的标志［1，2］。研究表明，体内蛋白质硝基化的两条主要通路包括过氧亚硝基离子(peroxynitrite，ONOO－)依赖途径和亚铁血红素/亚硝酸钠/过氧化氢(heme/NaNO2/H2O2)途径［1］。目前，对ONOO－依赖途径关注较多，而对heme/NaNO2/H2O2途径研究较少，但是在生理病理条件下，究竟哪种途径起主要作用，还未有结论。红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorius L)的干燥花，是传统的活血化瘀类中药。目前认为，红花活血化瘀的主要成分集中在水溶性的黄色素部分，红花黄色素中含量最高且具有活性的成分为羟基红花黄色素A(Hydroxysafflower yellow A，HSYA)［3］。研究表明，HSYA具有心脑血管保护作用，其机制与抑制血小板聚集、抗氧化应激等作用有关［4～6］。本研究通过体外构建heme/NaNO2/H2O2硝基化途径，观察该途径能否产生脑组织蛋白质硝基化修饰以及HSYA对该途径引起的蛋白质硝基化是否具有抑制作用，为HSYA在预防和治疗脑血管疾病和神经系统变性疾病等领域提供分子机制方面的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠20只，体重340±10g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。分笼喂养，于室温、自然光环境下给予充足的食物和水，自然昼夜循环。所有动物均于实验室饲养1w后进入实验。

1.1.2 主要试剂和药品 (1)一抗:鼠抗硝基酪氨酸单克隆抗体(工作浓度为1∶1000)购自美国Cayman Chemical公司;鼠抗甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(工作浓度为1∶1000)购自北京中衫金桥生物技术有限公司。(2)二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG(工作浓度为1∶2500)购自北京中衫金桥生物技术有限公司。(3)其他试剂和药品:氯化高铁血红素(ferriprotoporphyrin IX，Hemin)和牛血清白蛋白(BSA)为美国Sigma公司产品，Hemin溶于二甲亚砜(DMSO，美国Sigma公司)溶液中，储存液浓度为10mmol/L，使用时以浓度为0.1mmol/L的氢氧化钠稀释至所需工作浓度，避免反复冻融;苯甲基磺酰氟(PMSF)为北京索莱宝科技有限公司产品;考马斯亮兰R－250为美国Amresco公司产品;Super ECL Plus超敏发光液为美国Pierce公司产品;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜为美国 Millipore公司产品;羟基红花黄色素 A (Hydroxysafflor yellow A，HSYA)冻干粉由浙江永宁药业股份有限公司惠赠;过氧化氢(H2O2)、亚硝酸钠(NaNO2)均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 恒温水浴箱购自德国Julabo公司;Western blotting电泳与转膜系统为美国BIO－RAD公司产品;低温超速离心机为德国Heraeus公司产品;凝胶成像仪为美国Syngene公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 (1)对照组:反应底物为组织蛋白或BSA，反应体系为hemin、NaNO2、H2O2; (2)低、中、高3个药物浓度干预组:在对照组的基础上分别加入终浓度为0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L的HSYA。

1.2.2 组织蛋白提取 SD大鼠处置前12h禁食，自由饮水。10%水合氯醛麻醉后断头处死，冰盒内快速分离大脑和心脏，用4℃生理盐水漂洗组织，并仔细去除蛛网膜，用滤纸吸干组织表面的液体。组织称重后，切碎置于4℃磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH 7.4)中，并加入PMSF(终浓度为0.2mmol/L)，于冰上研钵充分研磨，静置30min，4℃13000r/min离心15min，取上清备用。Lowry法进行蛋白浓度测定。

1.2.3 体外heme/NaNO2/H2O2途径诱导蛋白质硝基化 Heme/NaNO2/H2O2反应体系:Hemin 100μmol/L、NaNO210mmol/L、H2O21mmol/L。不同浓度的 HSYA(终浓度分别为 0、0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L)与BSA(终浓度为2mg/ml)或组织蛋白(终浓度为9mg/ml)37℃水浴预孵育5min，之后加入heme/NaNO2/H2O2反应体系，继续37℃水浴孵育30min，取出冰上终止反应。

1.2.4 Western blotting法检测3－NT表达 上述反应液按照蛋白样品体积与4×上样缓冲液体积为3:1的比例加入4×上样缓冲液，混合后煮沸15min，冰上冷却。取50μg蛋白样品上样，于体积分数为10%十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)中分离，初始阶段维持电压80V，待溴酚蓝进入分离胶时电压调至150V，至溴酚蓝跑出分离胶时终止电泳。转至PVDF膜上，80V电压共转膜80min。磷酸盐缓冲液冲洗PVDF膜10min(×3次)，5%脱脂奶粉室温封闭2h;加入一抗(鼠抗硝基酪氨酸单克隆抗体)，于4℃孵育过夜;PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，磷酸盐缓冲液冲洗5min(×3次)。Super ECL Plus超敏发光液按照比例(1∶1)混合后加于PVDF膜上，在凝胶成像系统中激发，采集图像。磷酸盐缓冲液冲洗显影后的PVDF膜5min(×3次)，浸于10ml洗脱缓冲液［含62.50mmol/L Tris－HCI(pH值6.80)，体积分数为2%十二烷基磺酸钠(SDS)，100mmol/L β－巯基乙醇］，55℃恒温水浴箱孵育35min，磷酸盐缓冲液冲洗5min(×3次)，以GAPDH作为内参照物，检测步骤同上。Quantity One凝胶图像分析软件进行灰度值分析，目的蛋白质灰度值与参照物灰度值进行对比。组织蛋白选用GAPDH作为内参照物;而BSA电泳后的凝胶则用考马斯亮兰着色以测定其上样总蛋白量。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计分析。所得实验数据以±s表示，两样本均数的比较采用两独立样本的t检验;多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较行LSD－t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSYA对体外heme/NaNO2/H2O2途径引起BSA硝基化的影响 Western blotting检测结果显示，BSA在 heme/NaNO2/H2O2反应体系(hemin 25μmol/L、NaNO25mmol/L、H2O21mmol/L)中孵育30min可被显著硝基化，分别加入 0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L HSYA，可不同程度地抑制该硝基化(Nitro－BSA)反应，以1mmol/L HSYA的抑制作用最明显(见图1)，与对照组相比，差异具有统计学意义(P均＜0.05，见表1)。

2.2 HSYA对体外heme/NaNO2/H2O2途径引起脑组织蛋白质硝基化的影响 以Western blotting法检测脑组织蛋白质体外硝基化水平，同时以心肌组织蛋白质作为对照。结果显示，在与BSA相同的heme/NaNO2/H2O2反应体系中，脑组织蛋白质未显示硝基化反应，但心肌组织可检测到3－NT的存在，1mmol/L HSYA可抑制心肌蛋白质硝基化反应，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05，见图2、表2)。之后进一步增加heme/NaNO2/H2O2体系的反应浓度(hemin 100μmol/L、NaNO210mmol/L、H2O21mmol/L)，脑组织可检测到大量3－NT的存在;分别加入 0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L HSYA，可不同程度地抑制该硝基化反应，以1mmol/ L HSYA的抑制作用最明显(见图3)，与对照组相比，差异具有统计学意义(P均＜0.05，见表3)。

图1 HSYA对体外heme/NaNO2/H2O2途径引起BSA硝基化的影响

图2 HSYA对体外heme/NaNO2/H2O2途径引起心肌组织蛋白质硝基化的影响

图3 HSYA对体外heme/NaNO2/H2O2途径引起脑组织蛋白质硝基化的影响

表1 不同浓度HSYA干预后Nitro－BSA表达水平的比较(±s，相对灰度值)

表1 不同浓度HSYA干预后Nitro－BSA表达水平的比较(±s，相对灰度值)

组间两两比较行LSD－t检验:(1)∶(2)～(1)∶(4)P均= 0.000;(2)∶(3)P=0.001;(2)∶(4)与(3)∶(4)P均=0.000

组别 样本例数 Nitro－BSA F值 P值对照组(1)低浓度组(2)中浓度组(3)高浓度组(4) 5 5 5 5 2.31±0.06 1.55±0.09 1.37±0.05 0.74±0.05 490.852 0

表2 HSYA干预后心肌组织3－NT表达水平的比较(±s，相对灰度值)

表2 HSYA干预后心肌组织3－NT表达水平的比较(±s，相对灰度值)

组别 样本例数 3－NT t值 P值对照组HSYA干预组5 5 21.68±1.36 15.40±1.24 7.599 0

表3 不同浓度HSYA干预后脑组织3－NT表达水平的比较(±s，相对灰度值)

表3 不同浓度HSYA干预后脑组织3－NT表达水平的比较(±s，相对灰度值)

组间两两比较行LSD－t检验:(1)∶(2)P=0.002;余P均= 0.000

组别 样本例数 3－NT F值 P值对照组(1)低浓度组(2)中浓度组(3)高浓度组(4) 5 5 5 5 16.70±1.25 14.50±1.03 11.58±0.89 0.45±0.09 302.633 0

3 讨论

Heme/NaNO2/H2O2途径是蛋白质硝基化途径之一，在该途径中H2O2与NaNO2是使硝基化发生的必需物质［7］;heme的主要成分为原卟啉IX和铁，而铁是其发挥催化作用的关键物质［7～9］，在体内主要存在于血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素类物质、过氧化物酶等含铁卟啉的蛋白质中。Hemin为heme的氧化形式，具有同样的催化蛋白质硝基化的作用［7］。BSA为牛血清中分子量为68kDa的球蛋白，成分比较单一，而脑组织中蛋白质成分复杂，含有抗氧化与促氧化等物质，因此，我们在体外构建heme/ NaNO2/H2O2硝基化途径，首先研究HSYA对BSA硝基化的抑制作用，在此基础上，进一步研究HSYA对脑组织蛋白质硝基化的抑制作用。

本研究结果显示，BSA在 heme/NaNO2/H2O2反应体系中可被硝基化修饰;脑组织在该反应体系中也可被硝基化，且表现为多种分子量的蛋白质均可被硝基化。该结果提示，heme/NaNO2/H2O2途径可能参与了病理情况下脑组织蛋白质的硝基化修饰。Heme具有亲脂性和较强的促硝基化效应，极易渗透细胞膜和细胞器膜，造成脂质、DNA、细胞骨架的损伤［10］。大量研究表明，在发生出血性卒中、出血性脑梗死、颅脑创伤、神经系统变性疾病等病理情况下，局部过量蓄积的 heme具有神经毒性［10～19］。在发生出血性卒中后，富含血红蛋白的红细胞在病变局部蓄积，其分解后释放出大量的heme，同时在出血性卒中引发的氧化应激状态下，NO2－与H2O2生成增多，使heme/NaNO2/H2O2途径发生的可能性大大增加，导致蛋白质硝基化修饰［15，16］。同时在某些神经系统变性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化等)中神经元蛋白质硝基化也可能部分与heme或含heme的蛋白有关［17～19］。同时在这里值得提出的是，在与BSA相同的heme/NaNO2/H2O2反应体系中，脑组织蛋白质未显示硝基化修饰，而心肌组织中可检测到3－NT，可能与心肌组织本身富含肌红蛋白有关。

在本研究中，HSYA对BSA和脑组织蛋白质的硝基化修饰具有抑制作用，且该作用呈剂量依赖性;提示HSYA对heme/NaNO2/H2O2途径诱导的蛋白质硝基化反应具有抑制作用。目前研究认为，3－NT的生成是一种特殊的氧化反应［1，20］，因此应用抗氧化剂通常是抑制自由基、铁介导的蛋白质硝基化的策略［8］。HSYA属于黄酮类物质中的查尔酮类，其分子中含多个酚羟基，而后者已被证明具有清除羟自由基、抑制脂质过氧化等抗氧化功能［21］。因此推测，HSYA抑制heme/NaNO2/H2O2途径诱导的蛋白质硝基化可能为其酚羟基的作用。与本研究结果相一致，黄酮类中的其他物质(如黄芩素、槲皮素等)也被证明可抑制heme/NaNO2/H2O2途径诱导的蛋白质硝基化［22］。据此，我们推测HSYA对蛋白质酪氨酸硝基化修饰的抑制作用与其抗氧化作用密不可分，这可能与其本身分子结构和自由基清除能力有关。

综上所述，羟基红花黄色素A可剂量依赖性地抑制heme/NaNO2/H2O2途径在体外对脑组织蛋白的硝基化修饰，提示这可能是其对抗脑血管疾病与神经系统变性疾病的分子机制之一。

［1］Peluffo G，Radi R.Biochemistry of protein tyrosine nitration in cardiovascular pathology［J］.Cardiovasc Res，2007，75(2):291－302.

［2］Pacher P，Beckman JS，Liaudet L.Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease［J］.Physiol Rev，2007，87(1):315－424.

［3］祝 明，郭增喜.红花药材中红花黄色素含量的测定［J］.中药材，2000，23(8):458－459.

［4］Wei X，Liu H，Sun X，et al.Hydroxysafflor yellow A protects rat brains against ischemia－reperfusion injury by antioxidant action［J］. Neurosci Lett，2005，386(1):58－62.

［5］王 天，傅风华，韩 冰，等.羟基红花黄色素A对实验性心肌梗死大鼠的保护作用及机制［J］.中草药，2007，38(12):1853－1856.

［6］臧宝霞，金 鸣，司 南，等.羟基红花黄色素A对血小板活化因子的拮抗作用［J］.药学学报，2002，37(9):696－699.

［7］Bian K，Gao Z，Weisbrodt N，et al.The nature of heme/iron－induced protein tyrosine nitration［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100 (10):5712－5717.

［8］Lu N，Zhou G，Pei D，et al.Peroxynitrite and heme protein－mediated nitrative/oxidative modification of human plasma protein:the role of free radical scavenging vs.complex forming［J］.Toxicol In Vitro，2009，23(7):1227－1233.

［9］Lu N，Zhang M，Li H，et al.Completely different effects of desferrioxamine on hemin/nitrite/H2O2－induced bovine serum albumin nitration and oxidation［J］.Chem Res Toxicol，2008，21(6):1229－1234.

［10］Jeney V，Balla J，Yachie A，et al.Pro－oxidant and cytotoxic effects of circulating heme［J］.Blood，2002，100(3):879－887.

［11］Chen－Roetling J，Li Z，Chen M，et al.Heme oxygenase activity and hemoglobin neurotoxicity are attenuated by inhibitors of the MEK/ ERK pathway［J］.Neuropharmacology，2009，56(5):922－928.

［12］Chen－Roetling J，Chen L，Regan RF.Apotransferrin protects cortical neurons from hemoglobin toxicity［J］.Neuropharmacology，2011，60 (2－3):423－431.

［13］Dang TN，Robinson SR，Dringen R，et al.Uptake，metabolism and toxicity of hemin in cultured neurons［J］.Neurochem Int，2011，58 (7):804－811.

［14］Benvenisti－Zarom L，Chen－Roetling J，Regan RF.Inhibition of the ERK/MAP kinase pathway attenuates heme oxygenase－1 expression and heme－mediated neuronal injury［J］.Neurosci Lett，2006，398 (3):230－234.

［15］Robinson SR，Dang TN，Dringen R，et al.Hemin toxicity:a preventable source of brain damage following hemorrhagic stroke［J］.Redox Rep，2009，14(6):228－235.

［16］Levy YS，Streifler JY，Panet H，et al.Hemin－induced apoptosis in PC12 and neuroblastoma cells:implications for local neuronal death associated with intracerebral hemorrhage［J］.Neurotox Res，2002，4 (7－8):609－616.

［17］Zecca L，Youdim MB，Riederer P，et al.Iron，brain ageing and neurodegenerative disorders［J］.Nat Rev Neurosci，2004，5(11):863－873.

［18］Lee DW，Andersen JK，Kaur D.Iron dysregulation and neurodegeneration:the molecular connection［J］.Mol Interv，2006，6(2):89－97.

［19］Tohgi H，Abe T，Yamazaki K，et al.Remarkable increase in cerebrospinal fluid 3－nitrotyrosine in patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis［J］.Ann Neurol，1999，46(1):129－131.

［20］陈刚领，刘 俊，卞 卡.蛋白质特殊氧化与疾病关系的研究进展［J］.中国药理学通报，2009，25(5):561－565.

［21］金 鸣，李金荣，吴 伟.红花黄色素抗氧化作用的研究［J］.中国中药杂志，2004，29(5):447－449.

［22］Zhao Y，Li H，Gao Z，et al.Effects of flavonoids extracted from Scutellaria baicalensis Georgi on hemin－nitrite－H2O2induced liver injury［J］.Eur J Pharmacol，2006，536(1－2):192－199.

Study on the inhibitory effect of Hydroxysafflor yellow A to brain protein nitration in vitro

ZHAO Rui－jie，SUN Li，LIU Xing－miao，et al.(Department of Neurology，People’s Hospital of Xingtai，Xingtai054031，China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of Hydroxysafflor yellow A(HSYA)on brain protein nitration induced by heme/NaNO2/H2O2system in vitro.MethodTo simulate in vivo heme/NaNO2/H2O2system－induced nitrative pathway，with bovine serum albumin(BSA)and brain protein for nitrification substrates respectively，preincubated with or without HSYA(at final concentrations of 0.01，0.1，1mmol/L)at 37℃ for 5min，and then Hemin，NaNO2，H2O2were added，the mixture was further incubated at 37℃ for 30 min，which could be detectable by Western blotting using anti－nitrotyrosine antibody.ResultsHeme/NaNO2/H2O2system could induce significant protein tyrosine nitrative modification to BSA and brain protein in vitro.HSYA pretreatment showed a very strong capacity to dose－dependently inhibitionion in 3－nitrotyrosine formation，especially at highest concentration(1mmol/L)，the differences between with and without HSYA were statistically significant(P＜0.05，for all).ConclusionHSYA could dose－dependently inhibit brain protein nitrative modification induced by heme/NaNO2/H2O2system in vitro，which may be one of the molecular mechanisms to against cerebrovascular and neurodegenerative diseases.

Hydroxysafflor yeHow A;Heme;Protein nitration

Q51

A

1003－2754(2013)03－0204－04

2012－11－01;

2013－01－12

国家自然科学基金资助项目(81070968)

(1.河北省邢台市人民医院神经内二科，河北 邢台054031;2.天津医科大学总医院天津市神经病学研究所，天津300052)

孙 莉，E－mail:sunli_2000@hotmail.com