运动性和高血压性心脏肥大心肌间质胶原网络重塑及其对左心室功能的影响

魏晓峰，魏 伟，史娇娇，贾斯媛，周丹丹

(1．东北农业大学体育部，黑龙江哈尔滨 150030;2．沈阳体育学院研究生部辽宁沈阳 110102)

实验性高血压大鼠是研究高血压病机理的重要工具和模型［1］。实验性高血压性心肌肥厚大鼠伴随着肾素－血管紧张素－醛固酮系统(RAAS)的激活。这些高血压动物心脏是以收缩蛋白的组成成分改变为特点，并伴有心脏功能的降低、细胞外基质成分的改变［2，3］。这些结果表明，心脏功能和结构的异常至少部分是因为细胞外基质胶原纤维的集聚。

研究表明，肾血管性高血压大鼠心脏的改变是由于左心室压力的增加以及循环中激素的改变所致［4］。高血压心脏细胞外基质的改变包括肌束膜、肌内膜、肌外膜细胞外总胶原的沉积。尽管心脏功能的改变已经得到研究，左心室功能的改变与细胞外基质的改变的直接关系仍需进一步的研究。

心肌细胞外基质的主要组成成分即心肌胶原的排列，影响着心脏的功能特性［4］。Ⅲ型胶原的主要作用是体现其顺应性，而Ⅰ型胶原的主要是反映其僵硬度［5］。Ⅲ型胶原纤维mRNA表达在新生期心脏压力负荷和容量负荷时就得到发展。然而，持续的慢性压力负荷以及肾素－血管紧张素－醛固酮系统(RAAS)的激活，Ⅰ型胶原在连接组织网状结构中表达逐渐增高［6］。

长期的运动训练可以改善心功能，并降低慢性高血压和肾素－血管紧张素－醛固酮(RAAS)系统的活性，运动训练对心功能的改变与亚细胞活动的机制相联系，如腺苷三磷酸激酶的活性以及钙离子的运输［7］。运动诱导的胶原纤维的改变被认为是促成性心功能改变的原因，老年长期运动大鼠与不运动大鼠相比，长期的耐力训练部分抵消了由于年龄而导致的心肌胶原的沉积［8］。然而，长期的跑台耐力训练以及举重训练并没有改变年轻大鼠左心室羟脯氨酸的含量。研究表明，心肌间质胶原纤维化与某些疾病和长期大强度训练密切相关［9］。本研究主要是为了比较运动(生理性)和实验诱导的高血压(病理性)大鼠心功能和心肌细胞外基质的改变。在本研究中，我们证实了耐力训练大鼠心脏和实验性高血压大鼠心脏心功能以及心肌胶原纤维的沉积和比例是不同的。

1 实验对象与方法

1.1 动物模型

雄性健康SD大鼠24只，随机分为手术组、非手术组、运动组和安静组，每组6只。手术组按照文献［10］的方法行腹主动脉结扎术，假手术动物除不行腹主动脉结扎外其他操作同手术组;运动组采用跑台运动的方式，每天跑60 min，每分钟30 m，5%梯度，每周5 d，持续10周［10］。安静组放在跑台周围，暴露在与运动组相同的环境刺激下，但是严格限制笼内的活动，笼内环境温度为22℃，50%湿度，自由进水和进食。

1.2 实验方法

1.2.1 心脏离体灌注及指标测定

大鼠在完成血压测定后，腹腔麻醉，开胸制备立体工作心脏。左室充盈压20kPa，主动脉静水压9.3 kPa。灌注液为改良Kreb Henseleit(KH)液，pH 7.4±0.05，温度(36±0.5)摄氏度;持续通入95%O2+5%CO2。聚乙烯管由心尖部插入左心室，另端连于SJ_42型四道生理记录仪，同步记录左室内压(LVSI＇)、左室内压最大变化速率(±dp/dt)、左室舒张末期压(LVEDP＇)，推算等容舒张期心室内压下降时间常数(T)值，定时收集1 min主动脉流出液(AF)和冠脉流出液(CF)，两者相加为心输出量(CO)［11］。

1.2.2 左心室羟脯氨酸的测定

称取左心室组织50 mg，匀浆器匀浆。加入盐酸高压水解2 h，NaOH调PH值到6.0，12 000 rpm离心15 min;取500 uL上清加入一新装备的试管中，依次加入柠檬酸缓冲液和高氯酸溶液以及氯氨－T溶液，水浴氧化25 min;高氯酸溶液1 mL，混匀，室温作用5 min终止氧化;对二甲基苯甲醛溶液1 mL，混匀，100℃沸水3 min(显色);冰浴冷却，各取200 uL分别加入酶标板，空白调零，和准备的标准品一起测定A560nm［12］。

1.2.3 Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分析

Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原用以前已经建立起来的方法从心肌组织提取进行分析。左心室组织经液氮固定，迅速称取300 mg心肌组织，放进置于冰上的试管内。组织经匀浆后，经离心机在4℃下8 500转离心10 min，弃上清。4℃下加入胃蛋白酶24 h，4℃下20 000转离心。加入氯化钠静止24 h，4℃下35 000转离心30 min，Wester－blot行Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的测定［13］。

1.2.4 心肌间质胶原的扫描电镜和投射电镜样品取材与制备

待心肌舒缩性能指标测试完毕后，摘取心脏，弃除心房、心室称重后，沿心轴切取中1/3心室肌横切快，蒸馏水冲洗，系列乙醇脱水，醋酸异戊脂过渡、干燥、真空喷镀仪镀金，扫描电子显微镜、投射电子显微镜观察、摄片［14］。

1.3 数据统计学处理

平均动脉压、左心室等容舒张期压力下降的最大速率行单因素方差分析。心脏重量，体重，心体比，羟脯氨酸的含量，Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比行T检验。Person相关分析左心室等容舒张期压力下降的最大速率与平均动脉压的比值和Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比值的相关性。显著性水平为0.05和0.01水平，统计值以均数±标准差表示。

2 研究结果

2.1 心脏重量和体重

尽管高血压大鼠的平均体重与训练组大鼠的平均体重没有差异性，训练组大鼠与对照组相比较，运动训练组体重显著低于对照组。(table 1;P＜0.05)。高血压大鼠与阴性对照组之间的差异没有显著性。心脏体重比以及左心室与体重比在训练组和高血压组都表现出明显的升高(P＜0.05VS对照;表1)。训练组大鼠以及高血压大鼠之间，训练组大鼠与对照组之间，高血压大鼠与阴性对照组之间，心脏重量与体重的比值的变化很可能是因为体重的变化所致。

表1 各实验条件下各组大鼠体重、心脏的重量以及左心室和体重的比值和心脏与体重的比值

体重和心脏的重量结果用均数加减标准差统计。XTr，训练组;Hyp，高血压组;Vw，心室重量。P ＜0.05VS.controls.

2.2 生理学指标的改变

高血压大鼠的平均动脉压(P＜0.05)始终较高，而训练组大鼠(P＜0.05)的动脉血压始终较低，支持高血压组大鼠患高血压的结论，手术后分析表明高血压大鼠的平均动脉压在用已丙去甲肾上腺素(Nad)刺激之前以及在刺激已丙去甲肾上腺素刺激1、2、3、4、5分钟后都表现出明显的升高(P＜0.05)。表明已丙去甲肾上腺素刺激后高血压大鼠平均动脉压升高显著(Fig，1)。而训练组在刺激 1、、2、3、4、分钟后平均动脉压始终保持较的状态。表明运动训练可以使大鼠对已丙去甲肾上腺素刺激的反映减弱(图1)。

图1 实验组大鼠的平均动脉压

高血压大鼠的平均动脉压在开始时以及用乙丙肾上腺素刺激后均较高。训练组与之相比低于高血压大鼠组。P＜0.05VS controls(△);+P＜0.05VS.controls.

心率和左心室内压的变化以及左心室内压变化最大速率无论是训练组与安静组对比还是高血压组与阴性对照组相比，都没有显著差异性。高血压大鼠和训练组大鼠的心率以及左心室内压变化最大速率在已丙去甲肾上腺素刺激后都升高但是在15 min后都恢复到原来的水平。但是这些变化刺激之前和刺激之后都没有变化(P＞0.05)。

左心室等容舒张期压力下降的最大速率是反映心肌舒张功能的指标，而左心室等容舒张期压力下降的最大速率又主要依赖于后负荷，所以我们用左心室等容舒张期压力下降的最大速率除以平均动脉压(－dp/dt)/MAP(弛豫率)，并以此来表示标准化的心脏舒张速率。高血压大鼠与训练组大鼠相比标准化了的心脏舒张速率低于训练组(P＜0.05;图2)表明了高血压诱导了舒张能力的下降。(－dp/dt)/MAP在注入已丙去甲肾上腺素刺激后训练组大鼠最快而高血压组大鼠最慢直到注入后2 min(P＜0.05与对照组相比，图2)。较低的比值表明了心室的舒张速率加快，而较高的比值则反映了心室舒张速率的减慢。这些变量表明训练组大鼠与高血压大鼠心脏舒张功能发生了显著的变化，在已丙去甲肾上腺素刺激后。训练组大鼠的舒张功能提高然而高血压组大鼠的心室舒张功能减弱。

图2 训练组大鼠(－dp/dt)/MAP的变化

2.3 胶原分析

高血压大鼠左心室羟脯氨酸的浓度明显升高，而训练组大鼠的并没有显著的升高(P＜0.05与对照组比较，图3)这些结果表明训练组大鼠总胶原的浓度并没有发生改变但是持续性高血压可以使总胶原的浓度升高。

图3 训练组、对照组、高血压组大鼠心脏左心室羟脯氨酸的浓度

高血压大鼠的左心室Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比值下降明显，而训练组大鼠并没有表现出相同的结果(P＜0.05，图4)。Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比值下降可能是Ⅰ型胶原表达升高或者是Ⅲ型胶原表达降低所致。因为Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比值与心脏的功能特性有关，相关性分析表明Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比值与(－dp/dt)/MAP存在明显的相关性(P＜0.05，R= －0.91;图5)。

图4 各组大鼠左心室Ⅲ/Ⅰ

图5 Ⅲ/Ⅰ与(－dp/dt)/MAP的相关性分析

2.4 扫描电镜观察

扫描电镜分析各组形态学特点，结果表明在各组大鼠的心脏结缔组织表现出明显的不同特征。每组大鼠结缔组织的排列相似，然而，在定量上却有明显的变化(图6，A－C)。特别是肌束膜的胶原纤维的量，连接在肌内层，而高血压大鼠相比，更丰富。训练组大鼠技肌束膜内胶原纤维的量比高血压大鼠低而与安静对照组相比，却高于安静对照组。虽然个体之间有一些差异性但是扫描电镜观察肌束膜的胶原纤维增加，而肌内膜的胶原纤维并没有增加。

扫描电镜观察结果表明胶原纤维与肌纤维膜相联(图6，D－F)。胶原量的变化在高血压大鼠与训练组大鼠以及对照组表现明显的不同。对照组大鼠与训练组大鼠相比有较少的纤维束与纤维膜相连，然而胶原含量生化测试表明，并没有定量上的差异。连接在及纤维膜上的胶原纤维的大小与高血压或者训练组相比要细。高血压大鼠大量的肌纤维束在心肌细胞与及纤维膜之间。而训练组大鼠中表现出适度的增加。

图6 各组大鼠左心室心肌纤维化程度的扫描电镜以及透射电镜观察结果

3 分析与讨论

在本研究中，高血压组大鼠和训练组大鼠心脏以及心室重量与体重比都有适度的增加。在肾素－血管紧张素－醛固酮系统(RAAS)激活的情况下慢性压力超负荷，高血压大鼠心脏主要经历了非均质的心肌重构，表现为非心肌细胞的不成比例的增长以及房室相称性的丢失的特点，细胞外基质中Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原的比例的丢失等特点。功能上病理学的重构表现为心室舒张功能的下降以及心脏僵硬度的增加，舒张速率下降。事实上，32周慢性肾血管性高血压舒张期的顺应性在正常的充盈量时就表现出下降，说明舒张期功能障碍伴随着左心室充盈压的增加。心肌细胞外间质胶原与舒张期功能的相互联系在以前的研究中已经有报道［15］。

尽管慢性高血压心脏的结构功表现出不利的特性，研究发现长期的运动训练可以改变这种不利的因素甚至可以提高心脏的功能［16］。运动性心脏肥大(－dp/dt)/MAP(弛豫率)表明是正常的或者有所提高。在本研究中，训练组大鼠的心室弛豫率被显著的提高了。运动诱导的心脏的适应性改变在功能上与慢性肾血管性高血压导致的改变完全不同。生理性心肌肥厚伴随着心肌收缩力的提高以及肌肉收缩速率的提高和ATP水解的正常或者间歇性的提高，体育锻炼所导致心功能的改变主要是由于心室的容积超负荷所致。相反，实验性慢性压力负荷过大伴随肾素－血管紧张素－醛固酮(RAAS)系统的活性增强则可以导致心肌收缩力的下降以及舒张功能的降低，生理性心脏和病理性心脏的改变实际上是导致两种心脏机械性能的增高或降低［17］。在本研究中，高血压大鼠的总胶原浓度显著高于训练大鼠。这种反映表现在高血压大鼠模型的心室肌细胞的改变以及心室壁的改变。实际上，心肌细胞外间质的改变与循环中的肾素－血管紧张素－醛固酮系统(RAAS)密切相关。研究发现左心室肥厚的人的心功能非正常化与间质性纤维化密切相关。

大量的试验证实实验性高血压大鼠心肌细胞外基质的改变与肾素 －血管紧张素 －醛固酮系统(RAAS)系统密切相关［18］。尽管循环的激素在本研究中并没有检测，这些激素在心肌重构中的作用需要进一步的研究。给实验性大鼠口服乙丙脯氨酸可以显著地降低大鼠左心室以及右心室胶原的沉积。表明阻止ACE的活性可以降低心室细胞外基质的集聚。

本研究表明，乙丙去甲肾上腺素刺激后心室的舒张功能发生了改变。这种药理学的因素被认为是心肌细胞面的肾上腺素的1和2受体有关，引起了最大的收缩性和变时性的刺激［19］。已丙去甲肾上腺素作为一种观察高血压和训练诱导增加了刺激的心脏的舒张功能的变化的工具。在肾上腺素的刺激下，Ca2+－ATP酶泵的活性被加强。这种蛋白在非磷酸化时期阻止了Ca2+泵。

本研究的结果表明细胞外基质由于胶原容量的改变以及胶原纤维的改变，训练组大鼠总胶原含量以及Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比与对照组相似，高血压大鼠的的总胶原含量显著增加，Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比显著下降。此外，Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原的比与心肌的弛豫率(－dp/MAP)密切相关。这些结果证明了细胞外基质结构在调节完整的心肌舒张功能方面起着重要的作用，与以前的研究结果相符合。细胞外基质胶原总量以及胶原纤维类型的改变与梗塞和高血压大鼠心肌层舒张期的紧张性相联系［20］。高血压心脏的损伤过程伴随着胶原纤维的沉积，这些心功能的降低至少部分是因为细胞外基质胶原的改变所致。

本研究中，高血压大鼠的左心室总胶原浓度增加以及Ⅲ型胶原与以型胶原比值的改变与心室弛豫率的改变密切相关。训练组大鼠胶原纤维类型的改变没有显著性，然而，(－dp/dt)/MAP(弛豫率)却显著性增加。支持了Ⅲ型胶原与Ⅰ型胶原比例的改变与弛豫率相关性的结论。心肌弛豫率与对照组相似，然而，在已丙去甲肾上腺素刺激后，训练组大鼠的心室弛豫率升高。运动训练也诱导肌球蛋白的组成的改变，以及ATP酶的活性的改变，Ca2+转运的改变。也包括心脏功能的顺应性改变。

两种大鼠模型在心脏功能方面以及其他方面表现出的差异性的机制还需进一步的研究。例如，高血压的应力提供了长久的刺激，在本研究中也证实动脉血压升高了在缩窄后的10周。相反，动脉压的升高仅仅发生在运动刺激的时候，这是间歇的刺激。激素的刺激，生理的因素与动脉血压的升高相关，如本研究的高血压大鼠的与运动训练组大鼠。

胶原的形态学分析很好地描述了安静组大鼠心脏与高血压大鼠心脏纤维化的不同。这些分析表明胶原的堆积在肌内膜，肌束膜，或者两者都有堆积。细胞外基质胶原的形态分布也支持了生化的测量结果，即高血压大鼠与训练组大鼠心脏胶原含量的差异。

4 结论

本研究证实大鼠心肌细胞外基质的组成以及内含物的改变心室的弛豫率密切相关。高血压导致心肌舒张能力的降低并伴随着总胶原量的增加，以及Ⅲ型胶原向Ⅰ型胶原的转化。另一方面，训练组大鼠心肌的舒张功能得到明显提高，并没有伴随着胶原总量的增加以及胶原类型比例的改变。这些研究结果支持了心脏的功能不仅取决于心肌细胞，心肌细胞外基质对于心脏的功能也具有重要作用的结论。这些研究结果同样说明了长时间运动大鼠以及高血压大鼠心肌细胞外基质结构的改变与功能的改变密切联系。

心脏的功能，除了要受到心肌细胞本身的调控外，心肌细胞外间质成分特别是心肌间质胶原纤维对心脏功能也起着重要的作用。适宜的运动训练可以使心肌实质成分与间质胶原协调增长，使心脏的功能进一步提高。慢性高血压可以使心肌实质成分与间质胶原呈非比例增长，过度增长的胶原纤维导致心肌舒张功能下降，心肌间质胶原与心功能有着密切的联系。

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