半胱胺对帕金森病小鼠模型多巴胺能神经元的影响

孙林娟 徐胜利 周 明 毛丽君 陈 彪 (中国中医科学院西苑医院神经内科，北京 0009)

目前帕金森病(PD)的治疗以增加脑内多巴胺(DA)浓度的替代治疗为主，随着用药时间的延长，药物导致的副作用严重影响患者的治疗。寻找具有多巴胺能神经保护作用和增加脑内DA浓度的药物成为研究的热点。半胱胺是美国食品和药品管理局(FDA)批准应用于胱氨酸病的药物，是细胞内正常存在的成分。研究证明，半胱胺具有抑制脂质过氧化、蛋白羰基化作用，提高超氧歧化酶活性、谷胱甘肽和过氧化氢酶的活性，促进细胞巯基储存和自由基清除〔1〕。半胱胺在亨廷顿病(HD)动物模型中具有保护DA能神经元的作用，已经应用于HD临床研究〔2〕。但半胱胺在PD中的研究未见报道，并且半胱胺的神经保护作用剂量报道不一。本研究旨在探讨半胱胺在PD动物模型中的效果，为半胱胺在PD中的应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 DA、MPTP、酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体均购自Sigma-Aldrich;HClO4及配制流动相所用试剂均为色谱级。

1.2 实验动物准备 取78只SPF级6～8周龄C57BL小鼠(由军事医学科学实验动物中心提供)，体重20～23 g。每笼5只，自由摄食、饮水;照明:黑暗时间为12 h:12 h。所有实验程序均按照实验动物指南(美国国立卫生研究院的出版物第80-23号，1996年修订);我们使用能获得有效实验数据的最少动物，尽量减轻动物的痛苦。给予小鼠腹腔注射0.9%生理盐水新鲜配制的 MPTP-HCl(20 mg/kg)，共5 d，首先2次/d×2 d，间隔12 h，继之1次/d×3 d。分组为:(1)对照组;(2)MPTP模型组;半胱胺预防组:(3)半胱胺20 mg/kg+MPTP组、(4)半胱胺75 mg/kg+MPTP组;半胱胺治疗组:(5)MPTP+半胱胺20 mg/kg组、(6)MPTP+半胱胺75 mg/kg组。半胱胺预防性给药分2个剂量组(半胱胺20 mg/kg，75 mg/kg)，半胱胺2次/d×4 d，第5天起同时给以MPTP;半胱胺治疗性用药与MPTP同天给药;总疗程14 d。

1.3 纹状体样品制备 末次药物注射后24 h，动物断头处死后，立即分离纹状体，自皮质前端与大脑中线交点向后1.7～3.5 mm区域与中线旁0.8～3.3 mm区域为双侧纹状体〔3〕，剥离皮层，将组织放入已经编号的一次性加盖塑料管中，投入液氮中保存。标本收集完毕后，转入－80℃冰箱保存。称重量后，每15 mg组织加入1 ml 0.4 mol/L HClO4，冰浴中超声破碎组织，功率200 W、超声2 s、间隔2 s，共5次;12 000 r/min 4℃离心12 min;离心2次，取上清待用;沉淀加入1 ml 0.5 mol/L NaOH，存放于－20℃，Lowry法检测其中的蛋白含量。

1.4 反向高效液相色谱-电化学(HPLC-ECD)检测器测定纹状体DA含量 色谱柱为ZORBAX SB-C18柱，4.6 mm×150 mm，粒径5 μm;流动相(新鲜配制并经0.22 μm的滤膜过滤)为0.035 mol/L无水枸橼酸;0.09mol/L无水醋酸钠，0.23 mmol/L辛烷基磺酸钠(SOS，Sigma公司);0.13 mmol/L乙二胺四乙酸，10%甲醇，pH4.7，流量1.0 ml/min，检测器工作电位0.50 V，灵敏度5 nA。配置不同浓度的DA标准品，标准品的质量浓度2～1 000 μg/L，做标准曲线，标准品与待测样品以20 μl进样，根据色谱峰面积进行定量。

1.5 免疫组织化学检测 末次注射半胱胺后24 h，用水合氯醛(100 mg/kg)深度麻醉小鼠后迅速开胸暴露心脏，剪开右心耳，经左心室快速灌注冰生理盐水50 ml和4%多聚甲醛100 ml。断头取出全脑，在上述固定液中后固定24 h，再依次放入30%的蔗糖溶液中，待脑组织下沉后修整中脑组织块，在冰冻切片机上进行冠状连续冰冻切片，片厚30 μm。切片放入0.01 mol/L PBS中进行漂片处理。切片的染色过程严格按ABC试剂盒说明书操作，过程包括:PBS漂洗5次，0.3%Triton-PBS 30 min，3%H2O230 min，PBS 漂洗 3 次，5%羊血清封闭30 min，在含1%胎牛血清、0.3%Triton的PBS液中加入兔抗酪氨酸羟化酶一抗(1∶10 000)，4℃冰箱中过夜;PBS漂洗3次，加入生物素标记的羊抗兔IgG二抗(1∶500)孵育2 h，PBS漂洗3次，加入HRP三抗工作液(1∶500);DAB显色。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。TH染色阳性的神经元计数方法:应用装载NIS-Elements成像软件的Nikon显微镜计数。每张切片双侧计数两遍，取平均数作为该张切片的阳性细胞数，计数各组的细胞数再取平均数，结果以各组神经元数量占对照组的%表示。

2 结果

2.1 MPTP对小鼠纹状体DA水平和黑质TH阳性神经元的影响 MPTP组纹状体DA水平比正常组下降了55%(26.38±6.47 vs 57.62±12.70，P＜0.01)。MPTP导致模型组TH阳性神经元的数目为对照组的56.37%(166.65±38.14 vs 295.65±47.46，P ＜0.01)。

2.2 半胱胺对MPTP模型小鼠纹状体DA水平的影响 半胱胺(20 mg/kg)预处理4 d再给予MPTP组有效地预防MPTP导致的多巴胺降低(47.96±10.57，P＜0.01);半胱胺(20 mg/kg)治疗组、半胱胺(75 mg/kg)预防和治疗组的多巴胺含量与MPTP模型组比较均没有统计学差异(36.27±16.42，25.65±7.71，25.08 ±8.10，P ＞0.05)。

2.3 半胱胺对MPTP模型小鼠黑质TH阳性神经元的影响半胱胺(20 mg/kg)预处理4 d再给予MPTP组有效地预防MPTP导致的TH阳性神经元的数目降低(267.45±34.01，P＜0.01)。半胱胺(20 mg/kg)治疗组、半胱胺(75 mg/kg)预防和治疗组的TH阳性神经元与MPTP模型组比较无统计学差异(179.55 ±38.11，172.10 ±32.68，174.05 ±35.77，P ＞0.05)。

3 讨论

PD临床症状的产生是由于黑质DA能神经元的退变和DA含量的减少。既有神经保护作用同时又能提高神经递质多巴胺水平的药物是治疗PD理想和有效的药物。本实验结果显示，我们证明半胱胺在20 mg/kg低剂量时可以保护MPTP导致的C57小鼠黑质TH阳性神经元和纹状体DA的丢失，与Tremblay等〔4〕报道的结果一致。

早期关于半胱胺的报道是给以C57小鼠半胱胺治疗后，半胱胺导致了剂量依赖性的纹状体DA浓度的增高。我们的实验显示仅仅在低剂量(20 mg/kg)时产生了保护作用，相对高剂量(75 mg/kg)没有显示神经保护作用。结果的不同也许来自于不同的给药方法和不同的给药频率和时间。在Oishi等〔5〕的研究中，半胱胺给以的剂量明显高于本次实验，但是半胱胺是在MPTP给药前30 min单次给予200 mg/kg。而在本次实验中我们给以小鼠半胱胺治疗14 d，明显长于以前的实验，半胱胺的总剂量在低和高剂量组分别达到了280 mg/kg和1 050 mg/kg，两者都高于以前的报道。因此，由高剂量的半胱胺导致的毒性作用也许反映了半胱胺的累积效应，半胱胺剂量效应对于神经功能的毒性作用也在HD小鼠模型中报道，在半胱胺的剂量达到600 mg/kg时产生了明显的认知功能的损害。Vecsei等〔6〕报道，在给予半胱胺后在不同脑区几乎都导致了去甲肾上腺素的丢失，但是DA的变化是选择性和双向性的。CS在低剂量时具有神经保护，而在高剂量则有毒性作用，表明了神经保护剂的双向作用效应〔7〕。尽管超剂量怎样导致神经毒性还是不清楚，这观察到的毒性仍然值得我们注意，在以后的实验和临床试验研究中半胱胺的剂量和给药时间都应该是被考虑的因素。综上所述，半胱胺可以保护由MPTP诱导的PD小鼠模型的DA能神经元的毒性，并且保护作用与给药的剂量和时间密切相关。在临床其他疾病中的有效性和安全性将使半胱胺在以后治疗包括PD在内的神经退行性变疾病中成为有效的治疗策略。

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2 Borrell-Pages M，Canals JM，Cordelieres FP，et al.Cystamine and cysteamine increase brain levels of BDNF in Huntington disease via HSJ1b and transglutaminase〔J〕.J Clin Invest，2006;116(5):1410-24.

3 Chan E，Kovacevic N，Ho SK，et al.Development of a high resolution three-dimensional surgical atlas of the murine head for strains 129S1/Svimj and C57Bl/6J using magnetic resonance imaging and micro-computed tomography〔J〕.Neuroscience，2007;144(2):604-15.

4 Tremblay ME，Saint-Pierre M，Bourhis E，et al.Neuroprotective effects of cystamine in aged parkinsonian mice〔J〕.Neurobiol Aging，2006;27(6):862-70.

5 Oishi T，Hasegawa E，Murai Y.Sulfhydryl drugs reduce neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP)in the mouse〔J〕.J Neural Transm Park Dis Dement Sect，1993;6(1):45-52.

6 Vecsei L，Ekman R，Alling C，et al.Influence of cysteamine and cysteine on open-field behaviour，and on brain concentrations of catecholamines，somatostatin，neuropeptide Y，and corticotropin releasing hormone in the rat〔J〕.J Neural Transm Gen Sect，1989;78(3):209-20.

7 Calabrese EJ.Dose-response features of neuroprotective agents:an integrative summary〔J〕.Crit Rev Toxicol，2008;38(4):253-348.