难溶性小分子药物微球体内外释放及相关性研究进展

陈玉玺，浦益琼，张 彤，陶建生，王 冰

(上海中医药大学，上海 201203)

药物体外筛选过程中，很多难溶性小分子药物都表现出很高的药理活性，比如羟基喜树碱、人参皂苷、紫杉醇等［1-3］。但由于这类药物溶解度低，生物利用度不高，或剂型选用不合理等因素限制了此类药物的临床使用［4］。结合需长期治疗的疾病，将难溶性小分子药物制成微球制剂发挥其长效和缓释作用，是解决此类药物长期给药及提高生物利用度的制剂手段之一。微球(Microspheres)是一种骨架型的骨架微粒，是液体或固体类药物溶解和(或)分散于高分子材料基质中，形成的粒径通常在1～250μm之间的类球形或球形微粒［5-6］。该剂型可以通过控制药物的释放速率达到缓控释的目的;可以通过控制其粒径使其具有靶向性，快速达到靶向区域所需的药物浓度，这样就可以降低药物给药剂量，减少药物对正常细胞组织的毒副作用;其制备方法广泛，适用于水溶性、难溶性药物，也适用于多肽蛋白类药物的制备。通过将难溶性小分子药物制成微球，使其发挥控制药物释放目的，已成为近年来开发难溶性小分子药物缓控释制剂的研究趋势。对于缓控释制剂研究来讲，如果能保证制剂中药物的体外释放实验与体内吸收实验结果具有较好的相关性，这样的实验数据才有实际意义［7］。

本文对难溶性小分子药物微球的体内外释放及体内外相关性方面的文献进行整理和分析，对已有期刊论文或学位论文常用研究方法进行了归纳和比较，列举了在考察难溶性小分子药物微球释放和吸收时常用的实验方法和条件，希望为该类药物微球制剂的体内外评价提供借鉴或参考。

1 难溶性小分子药物微球体外释放研究

微球体外释放试验主要考察在特定条件下微球中药物释放的速率，一般分为体外长期释放和体外加速释放试验两种。

1.1 体外长期释放试验 体外长期释放试验是在与体内生理环境相似的条件下考察药物的释放情况。在《美国药典》(USP34-NF29)和《英国药典》(BP2010)中缓释制剂的释放度检查项下均收载了流通池法。2000年以后，流通池法多被用于一些特殊剂型如药物释放支架、混悬剂、植入剂及微球等研究中，很多著名国际药企、药品研发机构的QC实验室经开始应用流通池法进行制剂的质量控制［8］，该方法操作简便、重复性好，适合于微球制剂的体外释放评价。目前《中国药典》2010年版未明确收载专门用于微球制剂的体外释放度测定法，文献调研表明，难溶性小分子药物微球大多采用动态透析法或桨法进行体外释放度测定。

1.1.1 动态透析法 动态透析法，即称取适量载药微球放入已平衡好的透析袋中，然后将其置于释放介质中进行振摇，定时取样检测的一种体外释放评价方法。该方法有利于透析膜内外介质的交换，避免了释放度测定中微球的损失以及介质pH的改变［9］。

李像等［10］采用乳化溶剂挥发法(S/O/W)制备多西紫杉醇聚乳酸羟基乙酸(PLGA)/纳米羟基磷灰石(nHA)复合微球，选用动态透析法考察两种微球的体外释放，释放介质为0.1%(W/V)吐温80的PBS溶液(pH 7.4)，将透析袋置于37℃恒温水浴振荡器内以80 r/min速度振荡，定时取出10 mL释放液，并补充等量新鲜释放介质，测定并计算微球中累积药物释放率。结果表明，微球中的药物经过体外突释后，在复合微球中比在常规PLGA微球中释放速度慢，而到达30 d时，复合微球和常规PLGA微球累积释放率分别为62.40%和72.70%。李祥等［11］制备脂溶性药物塞来昔布的PLGA缓释微球，并用动态透析法考察其体外释药特征，将塞来昔布微球和释放介质装入透析袋内，扎紧后将其置于含0.02%的叠氮钠的PBS(pH 7.4)溶液中，(37.0±1.0)℃水浴恒温，70 r/min搅拌;分别在设定的时间点取出1 mL介质，同时立即补加等量新鲜介质。结果表明，微球在1 d内无突释现象，40 d时药物累积释放69.1%。王海鸥等［12］采用动态透析法考察了姜黄素聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球的体外累积释放度;释放介质为含0.5%SDS-Na的PBS溶液(pH 7.4)，恒温(37℃)水浴振荡(70 r/min)，结果表明，微球71 h体外累积释药率为77%，表明微球具有良好的体外缓释作用。周荣平等［13］采用动态透析法，精密称取适量微球(含药约2 mg)，均匀分散于6 mL生理盐水中，装入密闭透析袋，置于 100 mL生理盐水中，在(37.0±0.5)℃，500 r/min条件下振荡，定时取出释放介质5 mL，同时补充新鲜生理盐水5 mL，进行处理检测分析，结果表明:微球在刚开始24 h内，药物有突释现象，利于药物的快速起效;24 h后药物大致呈现零级释放;释药9 d可达累积药物释放量87%。

1.1.2 浆法 浆法具有通用性强、耐用性高、仪器最为普及的特点，2010版《中国药典》二部附录X C有载，建议首选该法进行体外释放研究。

杨亚兰等［14］采用乳化交联固化法制备依托泊苷鼻用壳聚糖微球，桨法测定其释放度，以pH7.4磷酸盐缓冲液(含10%乙醇)250 mL为释放介质，转速100 r/min，温度(37±0.5)℃。结果表明其体外释药符合Higuchi模型。赵琳琳等［15］采用缩聚法制备姜黄素壳聚糖微球，采用浆法考察其体外释放，转速为100 r/min，温度为37℃，溶出介质为人工胃液，其中含有30%无水乙醇、2.0%十二烷基硫酸钠，结果显示微球在第5小时达到释放平衡状态，累积释放率高达90%以上。郭振勇等［16］利用桨法测定丙硫异烟胺微球及原料药的体外释放性能，精密称取丙硫异烟胺－PLGA微球适量，置透析袋内，紧密封口后混悬于50 mL含0.1%聚山梨酯-80的PBS(pH 7.4)的释放介质中，在(37±1)℃ 恒温水浴振荡器上震荡，取样后补充新鲜介质;结果表明，微球体外释药符合 Higuchi方程(Q=4.4303t1/2+7.7241)，释药较慢。

1.2 体外加速释放试验 微球是一种缓释剂型，药物从微球中释药一般需要数天、几个月甚至1年以上的时间，采用模拟体内条件的释放实验对其进行质量评价在实际操作中具有一定难度，因此用体外加速释放预测微球的释药速率，对微球的质量控制具有十分重要的现实意义［5，17］。

1.2.1 升温法 蒋朝军等［18］在研究微球体外加速释放时采用对释放介质升温的方法来达到。实验显示利培酮在不同温度下均呈零级释放，当温度从37℃升高到45℃时，释放时间也由15 d加速到了3 d。将45℃加速释放的0、1、2、3 d累积释放度与长期释放0、5、10、15 d累积释放度进行线性关系拟合，相关性良好，即可通过45℃的加速释放来快速评价此微球的释放特性。王辰允［19］在紫杉醇长效缓释注射微球的体外释放度加速测定中，采用50℃作为加速释放温度，同时振荡频率也由100 r/min提高到200 r/min，实验结果表明加速释放与体外常规释放的相关性良好。冼远芳等［20］在阿司匹林微球在体外加速释放实验中发现，载药量不同的两种微球37℃与55℃加速条件下释放均具有良好的相关性，相关系数分别为0.99574和0.99338，提示当释放温度高于聚乳酸玻璃化温度2～3℃的条件可以加速聚乳酸微球的释放。王恺源报道［21］，G2407-5微球在含 0.5%SDS的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，37℃和55℃的释放条件下，结果证明提高温度可以有效升高G2407-5微球的降解速度，使微球释放更快，可以很好的完成G2407-5微球在短时间释放的目的。

1.2.2 调整介质pH法 符旭东等［22］研究发现石杉碱甲微球的释药速度与释放介质的pH有着密切的关系;释药72 h内，释放介质盐酸浓度在0.1～1 mol/L时，微球的释药速度随pH降低而降低，当盐酸浓度降低至0.0001～0.01 mol/L时，释药速度则随氢离子浓度的增加而加快;72 h后微球在0.1～1 mol/L盐酸中的释药速度明显加快。杨阳等［23］为快速评价盐酸噻吩诺啡的释药特性，在加速释放实验中采用盐酸为释放介质，通过实验确定以0.0001 mol/L的盐酸(5%乙醇)溶液为加速释放介质，在55℃条件下，加速释药与体外长期释药实验具有良好的相关性。贺云霞研究发现［24］，pH值的变化对双氯芬酸钠壳聚糖-海藻酸钠缓释微球释放具有显著性影响，微球在酸性条件下和水中释药速率最慢，8 h累积释放量不超过40%;在人工肠液环境中缓慢释药，可达理想缓释效果;在pH梯度环境下，微球初期释药较少，当pH值升至6.8时微球释药出现突释，6 h内释药完全。

2 难溶性小分子药物微球体内释放

微球制剂中药物含量一般较低，为检测此类制剂体内释药情况，通常采用以下两种方法，即体内滞留法［5，25］和血药浓度法［5，26-27］。体内滞留法通过给药部位微球残余药量的测定来间接反映药物体内释放速度，大多选用大鼠、小鼠为实验动物，此法较易推广，但必须具有熟练的解剖技巧及操作技巧。血药浓度法为测定脑脊液或血中药物浓度以评价体内药物吸收情况，多选用大鼠、兔、犬等实验动物，此法要求有高精密度的分析仪器及熟练的操作技术。

2.1 体内滞留法 潘峰等［28］采用改良国外检测黄体激素释放激素的方法，考察O/O法制备的石杉碱甲注射用缓释微球体内释药，具体为:将石杉碱甲微球注入大鼠腹部皮下后，定时取出注射部位的微球和肌肉组织，匀浆处理后测定药物残留量，间接获取微球的体内释药速率。实验结果表明，微球释药呈三相模式，第一相是药物首日突释作用，第二相是药物缓慢释放的过程(1～3 d)，第三相药物以每日6.7%的释药速度按零级速率(r=0.9978)几乎释放全部药物(3～14 d)。杨阳等［29］在研究盐酸噻吩诺啡缓释微球体内释药时，混悬后于大鼠皮下注射，给药后定时剪取注射部位的皮下组织，测定残留药物量，计算出实际注射微球在大鼠体内的释药率。结果表明其在大鼠体内释药速率符合Higuchi方程 Q=20.49 t1/2－ 5.87，R2=0.9891。王彦君［30］研究微球粒径对白藜芦醇微球体内释药情况的影响时，以小鼠为研究对象，皮下注射微球后定时取样检测药物在体内的滞留量，结果显示，释放开始4 h，药物从5μm微球中释放量(20.36%)与20μm微球中的释放量(20.08%)相当;1 d后5μm微球中药物释放量(49.13%)明显快于20μm微球(35.20%);第3天开始，5μm微球体内释放量则明显慢于20μm微球;到第15天，20μm微球释放量已达97.25%，而5μm微球仅为75.16%。

2.2 血药浓度法 王九成等［31］制备包载氟维司群的3种微球，大鼠皮下给予3种不同处方的微球50 mg/kg 1次，利用LC-MS/MS法测定血药浓度并计算主要药动学参数，结果显示，制备的3种微球均具有缓释作用，从药物释放91 d的趋势可见，在3种微球制剂载药量相近的情况下，PLA-block-mPEG(相对分子质量比为40000∶2000)包载药物的微球半衰期较长，释放效果较好。程国华等［32］制备了汉防己甲素肺靶向聚乳酸(TET-PLA)微球，并采用反相液相色谱法测定家兔注射微球后的血药浓度，结果表明TET-PLA微球在家兔体内药动学过程符合二室模型，t1/2β为(286.49±237.55)min，AUC为(810.33±287.49)μg min/mL，该药在体内体现出缓释效果。

3 体内外相关性评价

按照2010年版《中国药典》二部中“缓控释制剂指导原则”中“只有当体内外具有相关性，才能通过体外释放曲线预测体内的情况”，指导原则将体内外相关性归纳为三种:①体外释放曲线与体内释放曲线(即由血药浓度数据去卷积而得到的曲线)上对应的各个时间点分别相关，这种相关简称为点对点相关，表明两条曲线可以重合;②应用统计矩分析原理建立体外释放的平均时间与体内平均滞留时间之间相关，由于能产生相似的平均滞留时间可有很多不同的体内曲线，因此体内平均滞留时间不能代表体内完整的血药浓度－时间曲线;③将一个释放时间点(t50%，t90%等)与一个药动学参数(如AUC，Cmax或tmax)之间单点相关，但只能说明部分相关［33］。

体内外相关性是指利用数学模型来描述药物的体外释放规律与体内特性(药物吸收量或血药浓度)之间的关系［34］。体内外相关程度的高低不仅与体外释放度和体内药动学测定方法有关，也与采用的数据处理及分析方法有关［35］。难溶性小分子微球体内释放/吸收数据处理多选用模型依赖法、反卷积法、统计矩法，然后再利用线性最小二乘法回归原理，将同批次微球体外释放曲线和体内释药/吸收曲线上对应的各个时间点的释放率和吸收率回归，判断其体内外相关程度。

3.1 模型依赖法 在点对点相关水平的分析中，体内吸收数据的处理可以采用模型依赖法，是根据药物动力学模型来计算，在实际应用时选择几个时间段将不同时间的体内参数吸收分数等对应时间的体外释放参数作图，建立相关性，该相关性水平较高且确定了体外释放与体内吸收之间的直接关系。对于在体内吸收呈一室模型的药物，按Wagner-Nelson公式计算各时间点的吸收百分率，而对于双室模型药物则可采用简化的Loo-Riegelman公式进行计算［35-36］。杨明世等［37］对尼群地平微球进行犬体内药代动力学以及体内外相关性的研究，根据药物在体内的过程为一室(单室)模型，采用Wagner-Nelson法计算药物在犬体内的吸收百分数，对0.5～6 h药物累积吸收百分数与对应时间的体外累积释放百分率(ft)进行线性回归方程拟合，其中当释放介质为17.4 mmol/L十二烷基硫酸钠时，体外累积释放百分数与体内吸收分数相关系数较好(r=0.9851)，方程为Fa=1.6458 ft－27.642。李凤前等［38］对靶向汉防己甲素缓释制剂进行体内外相关性评价，其中将体外释药百分数作为体外指标，靶部位的药效学指标作为体内释药指标，将汉防己甲素缓释制剂在1、5、10、20、30、60 min时药物的体外释放百分数对平均肺动脉压力下降百分数进行相关性分析，结果表明其相关性良好(r=0.9707)。王津等［39］对布洛芬微球进行体内外相关性评价，体外实验显示布洛芬的释药行为符合Higuchi方程，在大鼠体内的释药情况与单室模型拟合程度较高，同时对体外累积释放度(X)和体内吸收百分率(F)进行线性回归，得回归方程为F=1.5481X+5.1587(r=0.9887)，说明体外释放度与体内吸收分数具有良好的相关性。

3.2 反卷积法 反卷积(Deconvolution)法［40］是一种不依赖室模型而直接根据药代动力学数据得到药物体内动态信息的数学计算方法，尤其适用于隔室模型模拟困难和缓控释制剂的体内外相关性研究，其拟合结果准确可靠。梅康康等［41］研究非诺贝特缓释微球片的体内外相关性时，采用了反卷积法，将各时间点的体内吸收百分数与其对应的体外累积释放百分数进行回归分析，结果表明体外累积释放百分数和体内吸收百分数相关性较好(r=0.9225)。朱海燕［42］给家兔肌肉注射单剂量尼群地平聚乳酸微球，给药后定时从耳缘静脉取血，血样处理后HPLC法测定，采用反卷积法计算，结果尼群地平微球的体内累积吸收百分数与其体外累积释放百分率相关性显著(df=30，r1－0.001/2=0.554)。贺云霞［24］分别采用Wagner-Nelson法和反卷积法计算双氯芬酸钠壳聚糖－海藻酸钠缓释微球药物体内吸收百分数，与相应时间点的体外累积释放百分数进行线性回归，考察微球的体内外相关性，由试验结果可知:与Wagner-Nelson法相比，采用反卷积法计算得到的体内吸收曲线与体外释放曲线吻合度更好，相关系数更大(ft=1.1274 Ft-D+21.907，r=0.9711)，表明由反卷积法得到的体内外关系的数学模型优于Wagner-Nelson法，其体内外相关性研究结果更可靠。

3.3 统计矩法 统计矩法(Statistical moment method)［35-36，43］是应用统计矩分析法分别算出平均体内残留时间、平均吸收时间、平均体内释药时间以及体外平均溶出时间，从而通过处理体内外数据得到较高水平的相关关系。Chu等［44］在研究可降解的石杉碱甲微球制剂体内外相关性时，也尝试使用了统计矩法，并获得了较好的拟合相关性。李静［45］研究报道采用统计矩分析原理建立体外释放平均时间与体内平均滞留时间之间的相关性。研究结果表明，对应时间点的体外累积释放量与体内药动学参数显著相关(Y=3.4463X+4.6675，R2=0.9930)，提示可根据体外累积百分释放量预测体内对应时间点的体内药动学参数。

4 结语

对微球药物体外释放度测定，2000年以后国外多采用流通池法，而《中国药典》至今还未明确收载专用于微球的体外释放度测定方法，从已有研究来看，国内研究者多采用动态透析法或桨法测定，对于方法简便、重复性好的流通池法的相关实验研究则较少。

进行体外加速释放时，一般采用升温或调整释放介质pH等方法。升温多采用比聚合物玻璃化温度稍高的温度来缩短聚合物降解时间，该条件下聚合物变得松软，通透性有所增强，药物的分子运动也有一定程度地加剧。另外，由于聚合物微球的降解主要为酯键水解，故调整释放介质pH也可加速微球的降解，但相对于升高介质温度，调整pH加速的效果较为温和，因此只单纯通过调整pH不易达到加速微球释放，需要结合升温等其他操作来协同促进微球的加速释放。

在微球体内外相关性评价方法中，模型依赖法与反卷积法的分析结果是一致的，前者是后者的良好近似，后者对任何模型的药物均适用;反卷积法则是双向的，可以根据体内药动数据推算体内药物吸收数据，也可根据体外释放数据预测体内药时数据［35］。

本文主要是希望通过体外特性研究来预测药物在体内的释放行为，达到减少动物数量最终节省研究成本的目的。体外特性与体内行为两者之间相关程度，对于以微球药物体外释放特征预测体内药时曲线，指导和优化微球处方设计，以及确立更合理的微球药物体外释放测定方法都具有指导意义。现有研究文献多集中于微球体外或体内释放评价，对于体内外相关性的研究并不多，研究者可以多进行一些各种聚合物微球的体内外相关性研究。

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