空肠弯曲杆菌对氟喹诺酮类和大环内酯类药物耐药机制研究进展

蒋 月，盛鹏飞，张 陆

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是弯曲杆菌属的一种，属革兰氏阴性菌，是一种人兽共患病原体。该菌可以引起家畜流产不孕、乳房炎及幼畜禽腹泻和家禽肝炎。人类主要通过食用受到污染的动物产品、未经煮熟的禽肉和生牛奶等感染［1］，从而引起人的急性肠炎和食物中毒，并伴发反应性关节炎、肝炎和格林－巴利综合症等免疫性损伤性疾病［2］。近年来，空肠弯曲杆菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。在发达国家，空肠弯曲菌在腹泻病人中的分离率已超过了沙门氏菌和志贺氏菌。而在中国，空肠弯曲杆菌也是主要的腹泻病原菌之一［3］。大多数空肠弯曲杆菌肠炎是自限性感染，临床症状较轻的弯曲杆菌肠炎病例并不需要抗生素治疗，但是严重的感染和被拖延了的肠炎病例、败血症都需要抗生素治疗［4］，同时由于集约化养殖业快速发展，大量的抗生素尤其是氟喹诺酮类和大环内酯类药物也被应用到生产中，导致了日益严重的耐药性问题。本文就空肠弯曲杆菌对喹诺酮类和大环内脂类药物的耐药性机制研究进展做一综述。

1 空肠弯曲杆菌对喹诺酮药物耐药性产生的机理

1．1 喹诺酮类药物的作用靶位及抗菌机制 DNA回旋酶和拓扑异构酶是氟喹诺酮类药物作用于细菌的首要和次要靶位。DNA回旋酶是由2个A亚基（即GyrA）和2个B亚基（即GyrB）组成的四聚体，是一种与DNA复制整合及转录表达有关的Ⅱ型拓扑异构酶。A亚基由gyrA基因编码，可以切断、再结合和超螺旋化DNA链，而B亚基由gyrB基因编码，含ATP水解功能区，可促进ATP水解，为A亚基松解超螺旋供能。喹诺酮类药物是DNA回旋酶A亚单位的抑制剂，通过形成药物－DNA－酶复合物而抑制DNA回旋酶的活性，阻碍DNA复制，导致细菌死亡［2］。

拓扑异构酶Ⅳ亦为四聚体，由2个C亚单位（即ParC）和2个E亚单位（即ParE）组成，在DNA复制后期姐妹染色单体分离过程中起重要作用。C亚基由parC基因编码，负责DNA断裂和重接；E亚基由parE基因编码，催化ATP水解。编码gyrA、gyrB、ParC和ParE这些靶酶的基因的核苷酸顺序以及这些酶的氨基酸顺序都具有很大的相似性，parC基因、parE基因分别与DNA回旋酶gyrA基因、gyrB基因有同源性［2］。

1．2 空肠弯曲杆菌对喹诺酮药物耐药性产生的机理 随着环丙沙星、诺氟沙星等喹诺酮类抗生素在人医和兽医临床上的大量使用，包括空肠弯曲杆菌在内的许多病原菌对此类药物都产生了耐药性，而弯曲杆菌对喹诺酮类药物产生耐药性的机制主要是如下两点：药物作用的靶位改变和外排泵引起的胞内药物聚集量降低。

1．2．1 药物作用的靶位改变 在编码DNA回旋酶的gyrA基因和编码DNA拓扑异构酶的parC基因内有一个被称之为热点的喹诺酮类耐药决定区（QRDR）［2］。空肠弯曲杆菌对喹诺酮类药物的抗性主要是由于gyrA基因的QRDR区发生了数处点突变。gyrA基因上的突变可发生在多个不同的位点，也可以在同一位点。

以往研究学者对空肠弯曲杆菌螺旋酶gryA突变位点的报道如下：Drlica等（1997）认为弯曲杆菌在gyrA第125位的酪氨酸（Tyr）残基是催化DNA与蛋白质结合的位点，它的突变会造成弯曲杆菌对喹诺酮的耐药作用。Husmann（1997）等发现弯曲杆菌gyrA在86位发生的苏氨酸到异亮氨酸（Thr86Ile）的突变是导致弯曲杆菌喹诺酮耐药主要的突变位点。同样位置的突变也在Gerald（1999）等人的实验中发现。Wang（1993）等人还报道了弯曲杆菌gyrA基因在90位发生的天冬氨酸到天冬酰氨（Asp90Asn），70位丙氨酸 Ala到苏氨酸（Ala70Thr）的突变也是造成弯曲杆菌对喹诺酮药物耐药的原因。Ruiz（1998）等人还在临床肠炎病人的身上分离到gyrA基因在86位发生苏氨酸到赖氨酸（Thr86Lys）突变的弯曲杆菌，其环丙沙星的最小抑菌浓度（MIC）≥16mg／ml，萘啶酮酸的MIC≥128mg／mL［2］。Asp90Asn和 Thr86Lys的突变与中度耐药（MIC＝8～16μg／mL）有关，还有一些以较低频率出现的突变如：Thr86Ala、Thr86Val和Asp90Tyr突变，其中Thr86Ala突变时，弯曲杆菌对环丙沙星的 MIC为2μg／mL［5］。

尽管有这么gyrA多位点的突变，弯曲杆菌对喹诺酮的耐药机制中最重要最常见的是gyrA基因发生的 Thr－86－Ile突变［6］。Bolton在对环丙沙星及萘啶酸高度耐药（MIC＞32μg／mL或 MIC＞256 μg／mL）的空肠弯曲杆菌中发现了gryA的Thr－86－Ile和Asp－203－Ser突变，但并不是所有的高度耐药菌株都有以上两种突变，有些没有Thr－86－Ile的突变的高耐菌株有两株含有Asp－203－Ser突变，也有的菌株既没有 Thr－86－Ile也没有 Asp－203－Ser的突变［4］。 另 外 Ruiz 也 有 Thr86Ile－Pro104Ser 和Thr86Ile－Asp90Asn双突变导致两个氨基酸改变的报道，Thr86Ile－Asp90Asn双突变会导致弯曲杆菌对第三代喹诺酮类药物莫西沙星出现更强的耐药性，而单独的Thr86Ile突变后，弯曲杆菌对这种第三代喹诺酮类药物还是敏感的［7］。也许还有没有被发现的机制对空肠弯曲杆菌高氟喹诺酮类耐药有重要的作用。可见关于gyrA基因位点突变及其对高氟喹诺酮类耐药还需要进一步研究。

目前还未见关于弯曲杆菌gryB突变的报道，Wang等对13株分离于鸡的空肠弯曲杆菌进行诱导突变也未见gryB突变的的菌株［6］。关于弯曲杆菌属DNA拓扑异构酶靶位parC基因变化与抗性相关的报道也十分鲜见，仅见1998年的一个报道，指出其突变位置在Arg－139上。随后也有许多实验想扩增parC，但是都失败了，因此Payot认为空肠弯曲杆菌中可能没有parC基因，喹诺酮药物主要通过DNA回旋酶起作用，而较少与DNA拓扑异构酶发生作用，单独的DNA回旋酶gryA亚基的改变（如Thr86Ile）足以导致弯曲杆菌对氟喹诺酮类药物耐药表型［5］。关于喹诺酮类耐药决定区的研究还在不断的深入，随着更多的突变位点被确定，我们将对喹诺酮耐药的机理有一个更深刻的认识。

1．2．2 外排泵引起的胞内药物聚集量降低 Cme－ABC外排泵是空肠弯曲杆菌首要的外排泵系统，这个外排泵广泛存在于弯曲杆菌属细菌内，可以介导对包括氟喹诺酮类、红霉素、氨苄西林、四环素和氯霉素等多种抗生素的固有耐药性［8］。多药外排泵CmeABC也可以与gryA突变协同介导空肠弯曲杆菌对氟喹诺酮的高水平耐药性［5］。CmeABC外排泵由外膜蛋白CmeC和内膜RND转运家族蛋白cmeB和胞质融合蛋白CmeA组成［4］。CmeB蛋白在结构上和功能上都与其他革兰氏阴性细菌RND超家族的转运蛋白相似。Kurincic经试验发现CmeABC外排泵的转录成分cmeB基因被灭活后，CmeABC外排泵也会失活［9］，Payot检测了多重耐药空肠弯曲杆菌中cmeB的表达量，发现这些菌株的cmeB基因高表达，且菌株内环丙沙星的聚集量下降［5］。Pumbwe也测试了多重耐药空肠弯曲杆菌中cmeB基因的表达，发现1／3的菌株都高表达cmeB基因，这些菌株内积聚的环丙沙星也较少［10］，这些都提示了CmeABC外排泵与空肠弯曲杆菌喹诺酮类药物耐药性之间的关系。

Lin等描述了CmeABC外排泵的转录调节剂cmeR，cmeR位于cmeABC操纵子的启动子区域内，它是一个高度保守的TetR样的抑制剂，在空肠弯曲杆菌中的CmeR插入突变导致细菌对环丙沙星有更高耐药性，这和CmeABC的高表达有关［11］。Pumbwe检测多重耐药空肠弯曲杆菌也包含CmeR抑制物的Gly86Ala突变，另外也有cmeR基因的Gln9Pro突变，但是他们的具体功能还不是很清楚［10］。

CmeDEF是空肠弯曲杆菌的第二个外排泵，cmeF基因编码了此外排泵的RND型转运蛋白［11］。尽管CmeDEF基因转录，但其表达水平还是显著低于CmeABC［5］。Pumbwe调查了多重耐药空肠弯曲菌CmeDEF的表达，结果显示一部分细菌同时高表达cmeB和cmeF基因，但是没有菌株单独高表达cmeF基因［10］。随后Pumbwe等又证明一个外排泵可能对另一个外排泵有影响作用［12］。也有报道cmeF的突变并没有改变其对环丙沙星、红霉素、四环素和氯霉素的敏感性［9，13］。

在弯曲杆菌基因序列中还有许多编码其他转运蛋白家族（如 MFS、SMR、ABC和 MATE）假定外排泵的基因［5］。Ge等试验使包括cmeB和cmeF的8种假定外排泵基因失活，发现除了cmeB，其他外排泵基因失活不会影响空肠弯曲菌对氯霉素、环丙沙星、红霉素和四环素的敏感性［13］。由以上结果可见这些假定外排泵系统在空肠弯曲杆菌多重耐药性中的作用还需要进一步的研究。

2 空肠弯曲杆菌对大环内脂类药物的耐药机制

2．1 大环内脂类药物作用靶位及抗菌机制 蛋白质的合成是通过核糖体的催化进行的，细菌核糖体为70S核糖体，它由两个亚单位组成，分别为30S和50S。30S亚单位结合信使RNA（mRNA）并启动核糖体循环；50S亚基235rRNA上含有肤酞转移酶中心，能催化肽键的形成，把氨基酸连接到不断延伸的肤链上合成蛋白质。大环内酯类药物是抑菌类抗生素，主要是通过结合细菌核糖体50S亚基的23SrRNA引起肽酰tRNA的溶解进而干扰蛋白质合成来抑制细菌的生长。

2．2 大环内脂类药物的耐药机制 空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药机制主要是抗生素靶位突变和外排泵导致的抗生素外流［4］。

2．2．1 抗生素靶位突变 细菌核糖体50S亚基中的23SrRNA区域是大环内脂类药物的主要靶点，这个靶位的突变将会阻止大环内脂类药物与细菌的结合继而出现耐药［14］。抗生素靶位突变也是空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物耐药的最常见机制。空肠弯曲杆菌23SrRNA基因V区的2074和2075位置（等同于大肠杆菌的2058和2059位置）的核苷酸突变（A2075G、A2074C或A2074T）导致其对红霉素 等 大 环 内 酯 类 的 高 水 平 耐 药 性［9，15－16］。 其 中23SrRNA基因V区的2075位置的突变是其高度耐药最常见的机制，这个机制也在肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌等其他菌株中出现［17］。而23SrRNA基因V区的2074位置核苷酸的突变较少报道，Vacher等描述了同一株菌23S rRNA的2074位置发生了颠换突变同时发生了A2074C／A2075G的双重突变，他认为A2074T介导的是低水平的耐药，而且并不出现在所有的23S rRNA基因上［18］。Gibreel等报道了一株空肠弯曲杆菌的A2074G突变与红霉素的高水平耐药（MIC＝512μg／mL）有关，但是经过连续传代的A2074G的突变株没有A2075G突变株稳定［19］。

为了防止革兰氏阳性菌对大环内脂类药物的抗性，发展出了一种新的大环内酯类药物，酮内酯类抗菌药，例如泰利霉素就会对许多耐大环内酯类药物的链球菌有效［5］。Mamelli和Cagliero也报道，对红霉素等大环内酯类耐药的弯曲杆菌菌株会影响其对泰利菌素的敏感性，在有23SrRNA突变的菌株，MIC可从32到变化到＞128mg／mL［8，20］。而核糖体突变菌株对泰利霉素的亲和性比野生型的敏感株低［20］。

核蛋白L4和L22被认为是合成细菌70S核蛋白多肽排出通道的组成部分［21］。rplD和rplV为编码核蛋白L4和L22的基因［17］，他们的突变也会影响肽的合成及药物与细菌的结合，进而导致了弯曲杆菌对红霉素高水平耐药。在弯曲杆菌rplD主要有 以 下 3 种 突 变：Gly57Ala，Gly57Val和Gly74Ala［22－23］。对于rplV，在 L22的86或98位有3个或4个氨基酸的插入会导致大环内脂的耐药［22］。Corcoran描述了13株有特征性A2075G突变的弯曲杆菌中伴随着L4蛋白和L22蛋白中有一个或多的氨基酸替换，有时这种替换会和结构内6个连续氨基酸的插入或缺失有关［24］。另外不是所有核糖体蛋白L4和L22的突变都会导致红霉素的耐药性的改变，如L22蛋白的A103V碱基替换会导致空肠弯曲杆菌对红霉素的高水平耐药，但是L22蛋白的K15I、E111A、T114A和V121A，L4的V196A突变就不会对弯曲杆菌抗生素敏感性产生影响，因为它们不在与抗生素敏感性有关的区域内［4］。当然关于突变导致的大环内脂类耐药作用还需要进一步研究。

2．2．2 大环内酯类的外排泵 与GyrA亚单位中Thr86Ile修饰和CmeABC外排泵协同介导的氟喹诺酮类耐药性相似，CmeABC外排泵和23SrRNA基因突变可共同介导对弯曲杆菌大环内酯类药的高水平耐药［8，25］。CmeABC外排泵与细菌固有和获得性的抗性有关，其排出的抗生素除了氟喹诺酮类药性也包括大环内酯类药。Payot对禽和猪的耐喹诺酮和红霉素弯曲杆菌进行检测，发现对RND转运蛋白特异的外排泵抑制剂（EPI）PaβN可恢复低水平耐药（MIC＝8～16μg／mL）的菌株对红霉素的敏感性，但它不能恢复有23SrRNA突变的红霉素高水平耐药（MIC≥512μg／mL）菌株对红霉素的敏感性［26］。Kurincic也表明PaβN能恢复低耐药菌株对红霉素的敏感性，至少16～32倍提升高水平耐药弯曲杆菌对红霉素的敏感性［15］。这些结果都证明了CmeABC外排泵在弯曲杆菌固有红霉素耐药性和获得低水平红霉素耐药性中的作用。

Cagliero等对人源、禽源和猪源的对红霉素呈不同耐药的弯曲杆菌进行试验，结果编码CmeABC外排泵的转录成分cmeB基因被灭活后，CmeABC外排泵的失活会恢复无23SrRNA基因突变的低、中度红霉素耐药弯曲杆菌的敏感性，Mamelli等的试验中也发现了同样的发现。而在有23SrRNA基因突变的高度红霉素耐药弯曲杆菌中，cmeB基因灭活后，红霉素的MIC降低了128至256倍。弯曲杆菌大的此外排泵机制对酮内酯和泰利霉素也有效，相反，阿奇霉素受外排泵的影响较小［8，20］。

Hanninen报道CmeR会抑制CmbABC的转录，CmeR抑制位点的突变会导致外排泵的过表达进而增强了对许多抗生素的抗性［27］，Lin也指出cmeR突变株和体外环丙沙星诱导后的选择株都表现出包括红霉素的多重耐药性［11］。Pumbwe等也发现人和禽源的多重耐药菌有同样的模式［10］。这些结果显示了cmeR与空肠弯曲杆菌的大环内酯类耐药可能的关系。

CmeABC外排泵也可能有CmeEDF和外排泵其他的外排泵的共同作用并在减少大环内酯类药物敏感性起着重要的作用，这还需要进一步的研究。

3 结 语

空肠弯曲杆菌中最常见的氟喹诺酮类和大环内酯类耐药机制是gyrA基因和23SrRNA基因的突变，然而CmeABC外排泵也可协同介导高水平的氟喹诺酮类和大环内酯类耐药。外排泵的高表达可以导致弯曲杆菌的多重耐药并在弯曲杆菌的耐药中起着重要作用。当然其他的靶位突变和外排泵系统也需要进一步的研究。了解空肠弯曲杆菌对氟喹诺酮类和大环内酯类药物的有关的机制，不但能够为用药作出指导，还可以为耐药弯曲杆菌的防控作出重要贡献。

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