变应性鼻炎患者外周血中IL－27和Treg细胞的相关性分析

黄雪琨 杨钦泰＊ 陈玉莲 张富程 张革化

（中山大学附属第三医院1耳鼻咽喉科，2中心实验室，广州510630）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是耳鼻咽喉科常见病，近年发病率有逐渐增高的趋势。目前认为AR的发病机制主要是特应性个体接触致敏原后由IgE介导的递质释放、并有多种免疫活性细胞和细胞因子参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是参与变应性疾病的一类关键的T细胞亚群，能抑制调控病理和生理性的免疫反应，达到自我免疫耐受和免疫平衡的维持。CD4＋CD25＋Treg为调节性T细胞的主要类型之一，分泌细胞因子 TGF－β1（transforming growth factor－beta1）和IL－10，而叉头状转录因子p3（forkhead box p3，Foxp3）是其重要调控基因［1］。实验研究发现，CD4＋CD25＋Treg能有效地抑制Th2反应，因而避免了AR等变态反应性疾病的发生；而特应性患者体内Foxp3和CD4＋CD25＋Treg明显减少，显示Treg的免疫抑制效应减弱，导致炎症和 AR［2］。

IL－27是IL－12细胞因子家族的新成员，由p28和EB病毒诱导基因3（Epstein Barr Virus induced gene 3，EBI3）两个亚基构成异源二聚体。IL－27主要由树突状细胞分泌，其受体由 WSX－1和gp130两个亚基组成，表达于多种免疫细胞和非免疫细胞表面。IL－27与其受体结合后，通过激活下游的STAT1／STAT3途径调节初始T细胞的增殖和分化［3］。本研究通过ELISA及流式细胞术检测AR患者外周血中IL－27和CD4＋CD25＋Treg及其相关细胞因子IL－10、TGF－β1的表达，探讨IL－27和Treg在AR发病机制中的作用。

材料和方法

1.研究对象

2012年3月至7月我科收治的AR患者32例（AR组），其中男性20例，女性12例，平均年龄29.6岁。所有AR患者均符合诊断标准［4］，且不伴有鼻窦炎、哮喘及阿司匹林耐受不良等疾病，最近1个月内未接受全身或局部糖皮质激素治疗，未经抗组胺和免疫治疗。20例来自本院的健康志愿者（对照组），无变应性鼻炎症状，吸入性变应原皮肤点刺阴性，其中男性9例，女性11例，平均年龄30.9岁。所有参加者均在征得知情同意后接受实验。

2.主要仪器和试剂

流式细胞仪是美国BD公司的FACSCalibur机型，用Cellquest软件（BD公司）获取细胞数据并进行实验数据分析。ELISA检测采用美国Bio－Tek ELX－800酶标仪。T－reg试剂盒（Human Regulatory T Cell Staining Kit）购自eBioscience公司。抗人IL－27 ELISA kit和IL－10 ELISA kit购于美国eBioseience公 司、TGF－β1 ELISA kit 购 于 美 国RayBio公司。

3.标本的采集

清晨采集患者外周静脉血4ml，肝素抗凝，取2ml采用300×g离心15min后取血清，贮存于－20℃冰 箱 中，用 于 检 测 血 清 中 IL－27、IL－10 和TGF－β1的浓度。取2ml于3 h内进行流式细胞术检测Treg细胞。

4.流式细胞检测Treg细胞的百分率

标记测样管、对照管，各管加入以下抗体：CD4／CD25／Fox P3（测样管），Fox P3同型对照单抗CD4／CD25／Mouse IgG（对照管），加入100μl抗凝全血，室温避光孵育20min。加入1ml溶血剂，室温避光孵育10min，300×g离心5min，弃上清，加入1ml PBS悬浮细胞，300×g离心5min，弃上清，每管加入0.5ml的Foxp3固定液混匀，室温避光反应20min，用1ml PBS洗1次，300×g离心5min，弃上清，每管加入0.5ml Foxp3破膜液洗一次，300×g离心5min，弃上清，加入0.5ml Foxp3破膜液重悬细胞，室温避光反应15min，300×g离心5min，弃上清，测定管加入10μl PE Foxp3抗体，对照管加入10μl同型PE单抗，室温避光孵育30min。用1ml PBS洗一次，300×g离心5min，弃上清，加入0.4ml PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，CellQuest软件分析数据。

5.ELISA 法检测血清中IL－27、IL－10和 TGF－β1的浓度

按照ELISA试剂盒说明书进行检测，IL－27的灵敏度为9.5pg／ml，IL－10的 灵敏度 为 1pg／ml，TGF－β1的灵敏度为9pg／ml。

6.统计学分析

采用SPSS16.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料采用（±s）描述，组间比较采用独立样本t检验；IL－27的水平、Treg 细胞百分率、IL－10、TGFβ1水平之间的关系采用Pearson相关分析。以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1.AR组与对照组Treg细胞百分率的比较

AR组和对照组Treg细胞流式细胞检测示意图见图1，AR组和对照组Treg细胞百分率分别为（1.75±0.56）%、（4.76±1.75）%，AR组明显低于对照组，两组比较的差异有统计学意义（t＝7.45，P＜0.01）。

2.AR组与对照组血清中IL－27、IL－10和TGF－β1水平的比较

AR组、对照组血清中IL－27、IL－10和 TGF－β1的表达水平见图2－4。AR组IL－27、IL－10和TGF－β1的表达水平均低于对照组，两组之间的比较有统计学差异（t分别为4.77、3.50、9.51，P＜0.01）。

3.AR患者外周血中IL－27水平、Treg细胞百分率、IL－10和 TGF－β1水平的相关分析

Pearson相关分析显示AR患者外周血中IL－27和 Treg细胞百分率、IL－10、TGF－β1存在正相关（r分别为0.825，0.646，0.517，P＜0.01），Treg细胞百分率和IL－10、TGF－β1存在正相关（r＝0.622，0.738，P＜0.01），IL－10和 TGF－β1无相关性（r＝0.304，P＞0.05）。

讨 论

Treg细胞是目前发现的一种具有免疫抑制功能的重要细胞亚群，在维持机体免疫耐受方面有着不可忽视的作用。CD4＋CD25＋Treg占正常人和小鼠外周血和脾脏组织中CD4＋T细胞的5%－10%，在诱导对自身抗原耐受、自身免疫性疾病及过敏性疾病方面起着关键作用［1］。研究表明，特异性抗原诱导产生的Treg可以IL－10依赖的方式减轻急性过敏性气道炎症、气道高反应性及气道重塑［5］；Treg还可逆转由蟑螂诱发的过敏性哮喘［6］。Xu等［7］研究发现AR患者的鼻黏膜及外周血单个核细胞中的Foxp3＋淋巴细胞数和Foxp3 mRNA表达明显低于正常对照组。IL－10和TGF－β1是CD4＋CD25＋Treg分泌的主要细胞因子，发挥着免疫抑制作用［1］。本研究结果显示 AR患者外周血中CD4＋CD25＋Treg百分率降低（P＜0.01），TGF－β1低于对照组（P＜0.01），Treg细胞百分率和IL－10、TGF－β1呈正相关（P＜0.01）。提示Treg细胞免疫功能缺陷可能在AR发病中起关键作用。

Treg细胞的分化依赖于特定细胞因子的作用，TGF－β和IL－2是目前认为对Treg细胞分化十分重要的两种细胞因子。TGF－β能调节Foxp3的持续表达，稳定Treg的数目及其免疫抑制功能［8］，而IL－2对 Treg的发育和维持都有重要作用［9］。IL－27对Treg的调节作用存在争议。有学者认为在IL－27作用下，STAT3磷酸化并结合在Foxp3第二增强子上的沉默区，进而影响磷酸化Smad3在第一增强子上的结合，从而抑制Foxp3的表达和Treg的分化［10］；另有学者认为IL－27通过STAT1途径诱导Th1细胞因子从而促进Foxp3的表达和Treg的分化［11］。

研究表明，IL－27在许多炎症如大肠炎［12］以及自身免疫性疾病如多发性硬化症［13］中都发挥着至关重要的作用。缺失IL－27受体的小鼠气道反应加重，气道中嗜酸性粒细胞增多，血清IgE水平、Th2细胞因子（IL－4，IL－5，IL－13）也增高［14］。在小鼠哮喘模型中，NK细胞分泌的IL－27抑制Th2反应和过敏性炎症［15］。实验性自身免疫性眼炎（Experimental autoimmune uveitis，EAU）中IL－27通过促进Trl和CD4＋CD25＋Treg的增殖，从而抑制Th1和Th17的炎症反应［16］。本研究AR患者血清中IL－27水平低于对照组，提示IL－27可能参与AR的发病过程。而AR患者外周血中IL－27水平与CD4＋CD25＋Treg百分率、IL－10、TGF－β1水平呈正相关，提示 AR外周血中IL－27可能对CD4＋CD25＋Treg细胞分化和功能有免疫调节作用。因此进一步深入研究IL－27对Treg细胞的调节作用，为阐述AR的发病机制提供新的理论依据。

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