低强度脉冲超声波联合引导骨再生术对Beagle犬牙周骨开窗缺损修复效应的研究

高 翔 宋锦璘* 邓 锋 赵纯亮 王智彪

1（重庆医科大学附属口腔医院，重庆市口腔疾病与生物医学研究中心，重庆 401147）2（超声医学工程重庆市市级重点实验室，重庆 400016）

引言

先天畸形、外伤或牙周病等因素，常导致牙槽骨发生不同程度缺损，造成牙齿支持组织破坏，牙周附着丧失，最终导致牙丧失［1］。目前，治疗牙槽骨缺损的主要方法有植骨术、引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）以及引导骨组织再生术（guided bone regeneration，GBR）等［2］。其中GBR作为一种基于GTR理论发展而来的再生性手术，将GTR术与骨移植治疗联合应用，可以获得牙槽骨再生［3］。GBR术后，牙槽骨完全修复上颌区约需6个月，下颌区约需3个月［4］。术后由于口腔卫生差、吸烟、牙龈厚度不足等原因，常导致屏障膜早期暴露而影响疗效［5－6］，亟待促进牙槽骨修复、缩短修复时间的辅助疗法。

低强度脉冲超声波（lowintensitypulsed ultrasound，LIPUS）为强度低于100 mW/cm2的脉冲式超声波，具有产热相对较弱，无侵入性，具有促进牙周组织修复的潜力［7－13］。以往研究侧重LIPUS单独处理对牙周组织的影响［8－10］，尚未见 GBR与LIPUS联合应用对牙周骨开窗缺损生物学改建效应的相关报道。

本研究应用GBR辅以LIPUS处理Beagle犬尖牙牙周骨开窗缺损模型，通过Micro-CT检测及组织学分析，探讨LIPUS对GBR修复牙周骨缺损的影响，以期为LIPUS辅助治疗提高临床GBR疗效提供前期实验参考。

1 材料和方法

1.1 实验对象和材料

1.1.1 实验对象

12～18个月龄健康雄性beagle犬5只（重庆医科大学动物实验中心提供），体重7～11 kg。尖牙无龋坏，牙周情况良好，牙龈无红肿出血，牙槽骨无缺损。选择尖牙为实验牙，每只Beagle犬4颗尖牙按简单随机法分配到4个治疗组：LIPUS（90 mW/cm2，20 min/d）组、LIPUS（90 mW/cm2，20 min/d）+GBR组、GBR组、空白对照组。每组5颗实验牙。

1.1.2 实验药品

速眠新Ⅱ注射液（批号：005013，规格：1.5 mL/支，军事医学科学院军事兽医研究所）、地西泮注射液（批号：H50021483，规格：2mL：10 mg/支，西南药业股份有限公司）、康派特医用胶（北京瞬康医用胶有限公司）、医用超声耦合剂、2％盐酸利多卡因、盐酸肾上腺素注射液等。

1.1.3 实验材料和仪器

聚四氟乙烯（polyetrafluoroethylene，PTFE）膜（FP301100，厚度：0.01 mm，Goodfellow Cambridge Ltd，英国）、低强度脉冲超声实验仪（国家超声医疗工程中心提供）、切片机（Leica RM2135型转轮，德国Leica公司）、Nikon DXM1200和NIS-Elements F3.0计算机图像分析系统（日本Nikon公司）、Micro-CT（μCT80瑞士）、HPIntegrity工作站（Itanium®2处理器，64位OpenVMS操作系统）等。

1.2 方法

1.2.1 构建Beagle犬尖牙牙周骨缺损模型

速眠新Ⅱ注射液复合地西泮注射液对Beagle犬实施全身麻醉。麻醉后将Beagle犬固定，消毒铺巾，口内2％碘酊消毒，75％酒精脱碘，严格无菌操作。含肾上腺素2％利多卡因注射液浸润麻醉。实验区颊侧牙龈做三角形切口，翻开全厚粘骨膜瓣，高速裂钻配合骨凿制备大小5 mm×5 mm矩形牙槽骨缺损，完全暴露尖牙根面，刮除残留牙周膜组织，平整根面，SSW HP-700裂钻沿缺损边缘在根面上做连续切迹以便组织学观测，同时在尖牙牙冠做“L”形标记，指示缺损位置，冠部“—”形切迹距离矩形缺损冠向边缘约15 mm（见图1中（a）～（c））。

1.2.2 GBR手术

选择下颌第一磨牙根分叉区牙槽骨作为供骨区，取适量牙槽骨，剪碎后放入生理盐水中备用。将备用骨质植入GBR和LIPUS+GBR治疗组缺损区，用量大致平齐缺损周围骨缘。高温消毒后的PTFE膜修整后（面积比缺损周缘大2～3 mm）用康派特医用胶粘结固定于牙槽骨面，覆盖植骨区［13］。生理盐水冲洗后，龈瓣复位，4-0丝线缝合关闭创面（图1中（d）～（f））。LIPUS组和空白对照组省略此步骤。术后连续4 d给予肌肉注射青霉素（80万单位/d）预防感染，术后 1周内进软食，每日用1.5％洗必泰局部冲洗，1周后拆线。

图1 牙周手术过程。（a）～（c）骨开窗建模；（d）～（f）GBR手术Fig.1 The process of periodontal surgery.（a）～（c）Fenestration wounds modeling；（d）～（f）GBR operation

1.2.3 LIPUS参数设定及处理方法

基于安全无创性原则，LIPUS治疗参数为ISATA 90 mW/cm2，频率1.5 MHz，调制信号波宽200 μs，重复率1 kHz，处理时间20 min/d［12，14］。连续4周（28 d）每天辐照1次。参考标记线位置放置超声治疗仪探头（见图2）。

图2 LIPUS处理Fig.2 LIPUS treatment

1.2.4 Micro-CT图像三维重建

4周后，过量麻药处死Beagle犬，用金属片切片将上下颌尖牙完整取出，4％多聚甲醛液（pH=7）固定1周。Micro-CT运行参数为电压55 kV，电流145 μA，图像矩阵2 048像素×2 048像素，层距0.037 0 mm。将标本固定放置于扫描容器中，保证扫描平面与牙长轴垂直，扫描方向从尖牙冠部至根尖部。获取Micro-CT扫描图像（见图3）后，在HP Integrity 64位工作站中对图像进行重建分析。对实验区进行三维重建，对不同组织通过不同显色和透明度区别观察缺损区牙槽骨再生情况。1.2.5 制备组织切片

图3 尖牙扫描后重建图像Fig.3 The reconstruction image of canine after scanning

Micro-CT检测后，在生理盐水冲洗下用金属片切片将实验区牙根及牙周组织（不包括牙龈）完整取下（边界大小10 mm×10 mm）并修整。10％EDTA 37℃恒温水浴脱钙2个月后，常规梯度脱水，浸蜡，石蜡包埋，沿牙根长轴做颊舌向连续切片，切片厚度5 μm。每个组织块选取中间段5张切片用于HE染色和Masson染色（4张HE染色，1张Masson染色）。计算机图像分析系统显微镜下采集组织切片图像。

1.2.6 组织学定量分析

用计算机图像分析系统（Nikon DXM1200和NIS-Elements F3.0）采集40倍下切片图像，并用IPP-6.0图像分析软件进行测量分析［7］，骨“开窗”缺损新生牙周组织生长模式如图4所示，测量切片缺损总面积、新生骨组织面积。

图4 骨“开窗”模型新生牙周组织生长模式图（N：根面切迹；NC：新生牙骨质；NP：新生牙周膜；NB：新生牙槽骨；BM：聚四氟乙烯膜；ST：软组织）Fig.4 The growth diagram of new periodontal tissue in fenestration defect（N：notch；NC：new cementum；NP：new periodontal ligament；NB：new bone；BM：PTFE membrane；ST：soft tissue）

（1）缺损初始面积（total defect area，TDA）：根面缺损的总面积。

（2）新生骨组织面积（new bone area，NBA）：缺损区新生骨组织的面积总和。

1.2.7 统计学处理

用SPSS13.0软件包进行统计学处理，数据用均数±标准差（¯x±s）表示，对相关资料进行随机区组设计的方差分析，组间比较进行LSD检验，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床愈合情况

骨开窗模型临床愈合情况有以下3种：（1）失败：龈瓣缺损，PTFE膜移位或脱落；（2）暴露：龈瓣缺损，PTFE膜暴露但没有脱落；（3）完全愈合：牙龈愈合良好，PTFE膜未暴露。失败和暴露牙位不纳入测量分析。各实验组临床愈合情况见表1。

表1 各实验组临床愈合情况Tab.1 The clinical healing between groups

2.2 实验区大体观察

各组牙槽骨缺损面积均不同程度缩小，新生组织从缺损周围标记处向中心生长，缺损处无明显炎症反应。LIPUS+GBR和GBR组PTFE膜被结缔组织包裹，固定于原处，未发生明显移位（见图 5和图6）。

图5 术中缺损大小Fig.5 The size of defect in operation

2.3 Micro-CT三维重建图像分析

从重建的三维图像中观察发现，各治疗组牙槽骨均有一定程度的修复。未进行GBR术治疗组，实验牙内新生牙槽骨面积较进行GBR术治疗组小，且牙槽骨表面空隙较多，提示新生牙槽骨的密度较低；进行GBR术的治疗组，实验牙新生牙槽骨密度较高，提示牙槽骨再生量较高；空白对照组新生牙槽骨表面空隙较多，提示新生牙槽骨密度较低，新生牙槽骨面积在各治疗组中最小；LIPUS+GBR组新生牙槽骨表面空隙较少，新生牙槽骨面积最大，提示新生牙槽骨密度较高，牙槽骨再生量较高。

图6 治疗后缺损大小Fig.6 The size of defect after treatment

2.4 组织学观察

2.4.1 LIPUS组：光镜下可见丰富的成纤维细胞，

胶原纤维束及新生毛细血管；成牙骨质细胞、成骨细胞功能活跃（见图7和图8），Masson染色新生组织中成熟骨组织胶原分布较广。

图7 成牙骨质细胞及新生牙骨质（HE染色，200×）Fig.7 Cementoblast cells and new cementum（HE Staining，200×）

图8 成骨细胞及新生牙槽骨（HE染色，400×）Fig.8 Osteoblasts and new alveolar bone（HE staining，200×）（HE staining，400×）

2.4.2 LIPUS+GBR组：PTFE膜与牙周组织接触良好，未见胶原纤维束穿过，膜下胶原纤维束及新生毛细血管丰富；成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞功能活跃；少量尚未吸收改建，大小不等移植骨颗粒分布缺损区，大量功能活跃的成骨细胞以植骨颗粒为支架编织合成新骨（见图9和图10）；陈旧骨与新生骨之间有明显交界线，Masson染色与LIPUS组类似。

图9 PTFE膜与周围组织（HE染色，40×）Fig 9 PTFE membrane in vivo（HE staining，40×）

图10 超声处理+GBR组织学表现（HE染色，40×）Fig.10 Histological performance in LIPUS+GBR group（HE staining，40×）

2.4.3 GBR组：缺损处以成纤维细胞及新生毛细血管为主，胶原纤维束较少，成牙骨质细胞靠近根面形成牙骨质，少量植骨颗粒散在分布，Masson染色新生组织中成熟骨组织胶原分布相对较少。

2.4.4 空白对照组：缺损处可见少量新生骨组织，新生骨组织以软骨胶原纤维为主，Masson染色显示主要为非成熟的骨组织胶原成分（见图11）。

2.5 组织学定量检测

各治疗组TDA无显著性差异（P＞0.05）；各治疗组新生骨组织面积及新生骨占初始缺损面积百分比（NBA％），组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

图11 空白对照组组织学表现。（a）HE染色，100×；（b）HE染色，200×；（c）染色Masson，100×Fig.11 Histological performance in control group.（a）HE staining，100×；（b）HE staining，200×；（c）Masson staining，100×

表2TDA，NBA及NBA％测量结果Tab.2 The measurements of TDA，NBA and NBA％

牙槽骨缺损修复的动物模型需满足两个要求：一是能够真实反应牙周组织修复的过程；二是利于准确评估处理因素对牙周组织的生物学效应［15］。本研究选择牙槽骨“开窗”模型为矩形“封闭”缺损，可有效排除外界感染因素的影响，有利于准确评估LIPUS在GBR治疗中的生物学效应。

由于具有与人类相似的牙周组织结构，犬常被用于牙周动物实验［16］。研究发现，犬下颌颊侧5 mm直径的环形牙槽骨开窗模型术后16周，通过自愈可获得完全牙槽骨再生［17］。急性牙周损伤建模后，动物组织的自愈性常导致对治疗方法效果的过高评介［18］。LIPUS处理时间过长，Beagle犬牙周组织的自愈性的影响可能会更大。Ikai等发现Beagle犬牙周翻瓣术后，连续4周LIPUS辐照后可以活化成骨细胞、牙周膜细胞，对牙周病组织愈合及牙槽骨修复有促进作用［11］。因此，本研究选择4周LIPUS处理时间，不仅可减少Beagle犬牙周自愈性对实验结果的干扰，而且有利于LIPUS与GBR联合应用对牙槽骨缺损早期修复效应的研究。

Micro-CT是一种高分辨率的三维重建影像技术，具有对组织无创、精确度高、直观性好等特点，主要应用于骨组织或口腔内牙体组织、牙槽骨组织的重建分析［19］。本实验利用HP Integrity工作站对Micro-CT扫描图像进行三维重建后，形态学观察显示，扫描后重建图像，牙体组织和牙槽骨组织图像清晰、真实、直观，牙根面的骨缺损标记线明显，为定量分析新生牙槽骨提供有力保证。但由于重建实验区域图像的密度值主要通过灰度值表达，在牙槽骨修复初期，骨纤维密度灰度值较低，在扫描图像上可能无法显示或者显示灰度值偏低，检测过程中可能造成部分样本丢失，使检测结果较实际组织成骨能力低［20］。此外，在图像重建过程中，牙周膜和牙龈等低密度组织不能显影，故Micro-CT无法对牙周膜和牙龈等组织的修复状况进行分析。因此，Micro-CT对牙周组织修复的检测具有一定的局限性，在实验中应结合组织学分析，以提高牙周组织修复分析的准备度和精确度。

LIPUS作为一种非侵入性机械能，不仅可以诱导成骨细胞分化，刺激细胞、细胞外基质增殖，加快钙盐沉积［21］，而且能增强人牙骨质细胞碱性磷酸酶活性，促进胶原合成［22］。本研究中LIPUS组与LIPUS+GBR治疗组HE染色切片可见大量成骨细胞与成牙骨质细胞，细胞形态成立方状，核大，细胞功能活跃，说明LIPUS处理具有促进成骨细胞与成牙骨质细胞功能活性的作用。此外，通过Masson染色对骨组织胶原的染色反应，可以评价骨质的成熟度［23］，LIPUS组与LIPUS+GBR治疗组新生组织Masson染色显示成熟骨组织胶原的分布较广，说明LIPUS能够促进新生牙槽骨中骨胶原合成，提高新生牙槽骨成熟度。

本研究通过组织形态学测量方法，评价LIPUS与GBR联合应用对牙周骨缺损牙槽骨修复的作用。研究结果显示LIPUS+GBR组较GBR组有更多的新生牙槽骨，统计学上具有显著性差异，说明LIPUS对牙槽骨修复具有促进作用，但是LIPUS+GBR组新生牙槽骨量有限，仅占缺损总面积8.08％～12.52％，缺损区胶原纤维束较多，原因可能是：移植骨主要为皮质骨，骨细胞及成骨细胞含量少，自身成骨作用有限，主要起支架作用，引导附近相关细胞进入缺损区形成新骨，该修复早期表现可能为先吸收再修复，由于实验时间只有4周，组织学反应主要表现为移植骨吸收。

4 结论

LIPUS辅助GBR治疗，在一定程度上可以促进牙周骨开窗缺损的早期修复。后续研究可考虑GBR术中选择适当的移植材料，比如牙周组织工程复合材料，通过组织工程支架直接引导成骨反应，以期进一步提高修复疗效。

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