基于光电倍增管的化学发光免疫检测系统的研制

孙福佳 陈烁烁 蔡锦达，3 尤黔林

1（上海理工大学机械工程学院，上海 200093）2（同济大学，上海 200092）

3（免疫诊断国家工程实验室，上海 200093）

引言

全自动的化学发光免疫分析仪作为一种新型的免疫检测系统，具有检测快速、稳定、结果准确等特性，它是以化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）为基础的血清检测方法［1－4］。世界各大仪器制造商均推出了集电子发光技术、纳米微粒子技术、生物素-亲和素系统、抗原-抗体免疫反应、电磁场分离为一体的自动化标记CLIA系统，并根据不同系统开发了针对不同临床指标的试剂盒［5－9］。目前国内市场有半自动分析仪，但主要以进口CLIA自动化系统为主，本研究利用 DSP和FPGA设计了控制系统和信号调理系统，从路径最优方法自主研发了全自动化学发光分析系统，该系统成功研发可以改变进口化学发光诊断试剂及仪器垄断国内市场的不利局面，提高国内该项技术整体水平。

化学发光免疫检测步骤是：步骤1：将患者的血清定量的吸取到反应杯中；

步骤2：根据检测要求加入相应的试剂、标记物、磁珠，在恒温下反应；

步骤3：对反应产物进行清洗及吸走废液；

步骤4：加入激发底物1、2；

步骤5：用光电探测器对反应产物所发出的光进行处理；

步骤6：控制器进行数据处理；

步骤7：上位机显示结果以及打印等与结果相关的操作。如图1为化学发光免疫检测原理。

图1 化学发光免疫检测原理Fig.1 Chemiluminescence immunoassay principle

论文首先基于 CR110型光电倍增管（PMT），设计了化学发光免疫检测总体方案，分析了免疫检测动力学原理，对化学发光免疫检测系统PMT采集数据进行处理，最后比较了国内外分析仪器检测结果。

1 化学发光免疫检测总体方案

全自动化学发光免疫分析仪采用流水式布局结构，如图2所示，反应杯从开始进入检测系统到废弃反应杯回收到垃圾站结束，整个运行过程按照检测流程自动监控，不间断工作，并且在进行每个步骤时保证每个动作互不影响、互不干涉，实现了整个检测流程的多功能、自动化、智能化。

化学发光免疫检测系统由信号检测系统和信号处理系统两个核心部分组成。信号测量以Altera的FPGA芯片EP1C3为核心，系统由光电探测器、信号转换和调理电路组成，信号处理系统以 TI的TMS320F2812为核心，由信号接口电路、信号采集及处理单元和人机交互界面组成。光电探测器采用CR110型PMT，CR110由日本滨松公司生产，其光谱响应范围为300～650 nm，最大响应波长420 nm，阳极脉冲上升时间4.0 ns，电子渡越时间30 ns，增益2.11×106，对采集光电信进行后续处理，根据发光过程曲线与血清样本浓度之间所建立的关系，计算出样本实际的浓度。如图3所示为检测控制系统总体方案。

2 化学发光免疫检测动力学原理

标记酶采用免疫诊断国家工程实验室的辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），发光体为Pierce的鲁米诺（激发底物），是一种稳定的有机化合物，它克服了吖啶酯易水解不稳定及其它酶催化发光的不稳定的缺点［10－12］。鲁米诺的化学发光是闪光型化学发光系统，属于慢发光，在加入鲁米诺后，5 s内达到峰值，以后快速衰减，加入增强发光剂后，发光强度可以保持 10 min 甚至更久［13－15］。利用鲁米诺的化学发光动力学曲线，再根据试剂标定曲线所确定的工作曲线，对样本血清进行定量分析。

图2 全自动化学发光免疫分析仪布局结构Fig.2 Automatic chemiluminescence immune analyzer's structure

图3 检测控制系统总体设计方案。（a）系统原理图；（b）系统实物图Fig.3 The design scheme of detection and control system.（a）principle diagram of system；（b）physical diagram of system

发光体为鲁米诺衍生物的化学发光系统，其光谱范围是410～430 nm，以波长为420 nm的光为主。单个波长其能量为：

式中，普朗克常数 h=6.67 ×10－34J·s，光速 c=3.0×108m/s，波长 λ =4.2 ×10－7m

酶标记物辣根过氧化物酶的总发光量与结合抗原的HRP的总发光量相等，达到峰值的时间以及峰值大小存在差异［16－18］。在没有加入增强发光剂的前提下，闪光型发光的发光过程可持续几分钟。经过实验测试，1 mol的纯 HRP，其发光总量约为3.27×1019RLU，取 1 RLU=10个光子。采用摩尔浓度为13.5×10－12mol/L的 HRP。发光总量为

N1=13.5 ×10－12×10－3×3.27 ×1019RLU=4.415×106个光子

在实际的检测过程中，摩尔浓度为13.5×10－12mol/L的辣根过氧化物酶，其化学发光动力学曲线在5 s内出现的波峰数值为2.5×105RLU，由此可计算出相应的发光功率。

出现波峰时的发光功率为

3 化学发光免疫检测系统PMT数据处理

数据处理是化学发光免疫检测系统中重要部分，检测结果就是根据数据处理结果来判定。要得到一样本血清检测项目是否正常，采用以下步骤。

步骤1：将同一批次的辣根过氧化物酶取出一部分A，从A中取出一小部分将其浓度稀释10倍，得到稀释液B，从B中取出一小部分将其浓度稀释10倍，得到稀释液 C，由稀释液 C得到相对 A浓度稀释1 000倍的稀释液D，同样得到相对A浓度稀释10 000倍的稀释液E；

步骤2：加入标准血清、抗体、磁珠之后，分别加入定量的浓度为A、B、C、D、E的 HRP，经过温育、清洗过程，再加入定量的鲁米诺过氧化氢，直接用PMT进行检测，反应5 s以后，对应1 s内的计数值分别为A'、B'、C'、D'、E'，根据A、B、C、D、E以及A'、B'、C'、D'、E'画出x-y关系图，确定的曲线为主曲线；

步骤3：为了提高检测精度，可根据所画的主曲线得出x-y的关系表达式，再将某一浓度的HRP进行步骤2的操作，检测数据在上述x-y关系图中标出（点O），将主曲线经过平移，使其通过点 O，从而得到矫正的主曲线，A、B、C、D、E对应的检测值为A″、B″、C″、D″、E″；

步骤4：将检测对象的检测梯度数据与A″、B″、C″、D″、E″构成新的 x-y关系图，该曲线为工作曲线。对某一血清样本进行检测，将检测到的光子数代入关系公式就可得到血清相应物质浓度的数值，通过该数值就可以知道血清中相应对象是否正常。

用流程图表示处理步骤，如图4所示。

图4 化学发光免疫检测系统数据处理步骤Fig.4 The data processing step of chemiluminescence immune analyzer

利用1 mg/mL的HRP原液制备浓度为X的HRP稀释液，再按照检测步骤制备浓度为 0.1X、0.01X、0.001X、0.000 1X的HRP稀释液。在加入标准血清、抗体、磁珠、HRP之后，再加入定量过氧化氢和鲁米诺发光液。测定上述5种浓度下5 s后的发光数，如表1所示。

表1 5种浓度的HRP对应的发光数Tab.1 Correspondence between the light-emitting number and 5 HRPs'concentration

根据表1，可得到浓度与发光数的关系，为了能线性化处理数据，横坐标 x为1/（－1－lg（稀释倍数）），纵坐标为发光数y，如图5所示。

公式为：

采用浓度为0.1X的HRP对主曲线进行矫正，其发光数经多次测量取平均值为693 405。

浓度与发光数的关系，如图6所示。

虚线曲线为矫正的曲线

HRP 浓度为 0.1X、0.01X、0.001X、0.000 1X下，对应的新的发光数为表2所示。

表2 5种浓度HRP在工作曲线中对应的发光数Tab.2 Corresponding light-emitting number of 5 HRPs'concentration in working

图5 浓度与发光数的x-y关系图（主曲线）Fig.5 The x-y figure between the light-emitting number and concentration（main curve）

图6 浓度与发光数的x-y新关系图（矫正的主曲线）Fig.6 The new x-y figure between the light-emitting number and concentration（correctional main curve）

检测梯度数据为 5、20、50、100、200。不同的检测对象，其检测梯度也不一样，这里是以泌乳素（prolactin，PRL）作为检测对象。

检测梯度与矫正主曲线中发光数的对应关系如表3所示。

表3 检测梯度与发光数的对应关系Tab.3 Correspondence between the testing gradient and the light-emitting number

检测梯度与矫正主曲线中发光数的工作曲线如图7所示。

公式为

选取浓度为0.1X的 HRP，酶标记物、抗体、加入磁珠经温育、清洗后加入激发底物对某一血清样本进行检测，其发光数测得1 207 920。则可通过工作曲线的公式y=8 178.8x－6 670.8，算出该血清的物质浓度值x=148.5 ng/mL。

图7 检测梯度与矫正主曲线中发光数的工作曲线Fig.7 Working curve between the testing gradient and the correction curve's light-emitting number

4 实验及其结果分析

为了检验测试结果的准确性，选择国外某公司生产的Liaison全自动化学发光分析仪和国内某公司生产的LUMO化学发光仪作为参照仪器，参照仪器在原理上（化学发光、PMT检测）、试剂上（鲁米诺、HRP等）都相同，由于LUMO是半自动化的化学发光仪，所以在检测过程中需要添加增强发光剂。

表4为3种化学分析仪在相同条件下所测量到的数值。表5是检测对象在3种化学分析仪对应的检测值。

从表4中的数据可以看出，LUMO由于所采用的PMT存在差异，灵敏度较低，导致在浓度较低的情况下，LUMO的检测值趋于不变，所以在计算结果的时候，需要去除几个“坏点”。用CR110与Liaison的数据进行比较，可以看出CR110的数据较稳定，但不排除这是环境因素或者其他的影响因素。

如图8所示为稀释倍数与检测值之间的关系，x和y坐标都取对数。图9为除2 000倍及其后面点数据的线形。

图8的3条直线，LUMO的拟合程度最高，该检测结果在一定范围内具有比较好的稳定性。但灵敏度相对另外两个来说处于劣势。其检测数值相对另外两者较小，因为它检测的取样之间为0.1 s，加上灵敏度等的影响因素。Liaison的拟合程度最低，但其检测灵敏度较CR110的稍高，而CR110的拟合程度介于两者之间，测量值在很大程度上跟索灵的相差不大，相差最大的是稀释50倍的那个点，可能是CR110在那一个点上计数快要达到饱和造成了这样的现象。

表4 3种化学分析仪在相同条件下的检测值Tab.4 Three chemistry analyzers'detection value in the same conditions

表5 被测样本的检测值Tab.5 The detection value of the measured samples

图8 稀释倍数与检测值之间的对数关系Fig.8 Logarithmic relationship between the dilution factor and the detection value

图9 稀释倍数与检测值之间的对数关系（去除了后面3个点）Fig.9 Logarithmic relationship between the dilution factor and the detection value（remove the last 3 points）

为了方便比较检测结果，采用图9中的3条直线来进行拟合。检测梯度与检测值的对应关系如表6所示，拟合直线如图10所示。

图中3条直线的拟合公式为

表6 检测梯度与检测值之间的关系Tab.6 The relationship between the testing gradient and the detection value

图10 检测梯度与检测值的拟合直线Fig.10 The fitted line between the testing gradient and the detection value

将表5中的数据代入上述公式可得到如下结果CR110：xa=51.724 ng/mL，xb=11.702 ng/mL，LUMO：xa=46.198 ng/mL，xb=15.133 ng/mL，Liaison：xa=43.792 ng/mL，xb=8.069 ng/mL，

正常的泌乳素浓度范围为4.0～15.28 ng/mL，从计算的结果可知，检测结果值之间虽存在差异，但总体阴阳性可以确定，满足应用需求。

5 讨论和结论

本研究整合直接化学发光和酶促化学发光两种发光为一体，并用 PMT进行快速自动检测其发光数，利用标定建立了发光数与泌乳素浓度的关系。通过与国内外的化学发光仪LUMO和Liaison的对比实验，可知本文设计CR110检测到的数据比较稳定，灵敏度介于 LUMO和Liaison之间，对样本泌乳素的检测结果与其他两种检测仪存在差距，但可以确定样本的阴阳性。

此外，本研究重点分析了化学发光分析仪的工作流程、工作原理以及化学发光免疫检测过程，选择了CR110型PMT作为本课题的光电探测器，提出了基于PMT的信号测量系统总体设计方案，设计了基于光电倍增管的化学发光免疫检测系统，详细阐述了数据处理过程，通过对比实验表明本研究设计的基于光电倍增管的化学发光免疫检测系统能够满足免疫分析需求。

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