大承气汤对MODS大鼠小肠肌层的保护作用

谢明征，胡志祥，齐清会

多器官功能障碍（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是一种病因繁多、发病机制复杂、病死率极高的临床综合征，亦是腹部外科患者死亡的重要原因。胃肠道是MODS的始动器官和靶部位，有效地促进胃肠动力的恢复可以阻断MODS的发生或进一步发展。大承气汤是中医通里攻下的代表方剂，在MODS的防治中已取得了确定且显著的疗效，但其机理尚不完全清楚。本实验以细菌性腹膜炎致MODS大鼠模型为研究对象，观察MODS大鼠模型和大承气汤（Da Cheng Qi Decoction，DCQD）治疗后小肠平滑肌环氧化酶-2（cyclooxygenase，COX-2）、核因子-κ B（nuclear factor-kappa B，NF-κ B）和热休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）蛋白的表达，并探讨MODS致胃肠运动障碍和DCQD的防治机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年清洁级Wistar大鼠100只，实验动物由大连医科大学动物实验中心提供。雌雄各半，体质量200～250g。随机分为对照组、MODS模型组和DCQD治疗组。

1.1.2 药物和试剂 中药大承气颗粒冲剂由天津南开医院药厂提供。成分为：大黄12g，芒硝6g，厚朴9g，枳实9g。每剂药物加入无菌蒸馏水36mL，溶解制成含生药100％的药业（1g/mL）。药物灌胃前加温至37℃。E.coli由大连医科大学附属第一医院检验科提供。小鼠抗大鼠NF-κB、小鼠抗大鼠HSP70、山羊抗大鼠COX-2抗体购自美国Santa Cruz公司。超敏即用型二步法（非生物素）检测试剂盒购自美国GBI公司，DAB显色试剂盒和中性树胶封片剂购自北京中杉金桥。

1.2 方法

1.2.1 MODS大鼠模型的制造和DCQD治疗 按照李毅等［1］方法，无菌条件下，对照组每只大鼠予腹腔注射1mL生理盐水；MODS组和DCQD组每只大鼠予腹腔注射1mL E.coli混悬液，建立细菌性腹膜炎致MODS模型。DCQD组于造模前2d给予大承气汤灌胃，2次/d，每次1mL/100g。

1.2.2 石蜡组织切片制备 取存活大鼠上端小肠，置于4℃的4％多聚甲醛中固定过夜。梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡切片机连续切片，每片厚度为5μm，附于多聚赖氨酸包被的载玻片上，60℃过夜。

1.2.3 免疫组织化学染色 按超敏即用型二步法（非生物素）检测试剂盒说明书进行：组织切片常规脱蜡、水化，3％H2O2去离子水孵育10min，抗原修复液沸水浴15min，一抗4℃孵育过夜，滴加试剂1，37℃孵育20min，滴加试剂2，37℃孵育20min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。以PBS代替一抗做阴性对照，已知阳性切片做阳性对照。

1.2.4 积分光密度 采用美国Media Cybernetics公司的Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）软件分析图像，计算小肠肌层阳性表达区域的积分光密度（integral optical density，IOD）。

1.3 数据处理 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理，计数资料采用卡方检验；计量数据用±s）表示，采用Studentt检验。P＜0.05表示有显著差异。

2 结果

2.1 动物死亡率 建模24h后，对照组大鼠共20只，均存活；细菌性腹膜炎致MODS组大鼠共40只，死亡23只，死亡率为57.5％，与对照组相比，具有显著差异（P＜0.05）；DCQD治疗组共40只，死亡11只，死亡率27.5％，与MODS组相比，具有显著差异（P＜0.05）。

2.2 大体标本 对照组：胃肠形态、蠕动正常，肠管呈粉红色，无粘连、肿胀。MODS组：胃肠明显扩张，浆膜充血肿胀，腹腔内大量渗出液，部分出现血性腹水，大部分肠管呈暗紫色，出现淤血斑，肠腔内见暗紫色血水样液体潴留，梗阻征象明显。DCQD治疗组：胃肠轻度充盈，肠管为红色，腹腔少量渗出液，无血性渗出，肠腔内少量淡黄色液体潴留，胃肠蠕动基本正常。

2.3 COX-2蛋白在大鼠小肠肌层中的表达 正常组大鼠小肠平滑肌细胞核轮廓清楚，分布均匀，COX-2蛋白散在分布。MODS组中小肠平滑肌细胞核分布不均，数量较正常组明显减少，环层肌中细胞核的长度较正常组缩短，纵层肌中细胞核的直径较正常组减小，COX-2蛋白的表达较正常组明显升高，且分布均匀。治疗组小肠平滑肌细胞核轮廓较MODS组清晰，数量和体积明显增大，COX-2蛋白的表达较MODS组明显减少，在环层肌中尤为明显，而在纵层肌中的表达呈不均匀性，部分区域较MODS组减少，而其他部分则升高（图1）。

2.4 NF-κB蛋白在大鼠小肠肌层中的表达 对照组大鼠小肠平滑肌层中未见或偶见NF-κB蛋白的表达。MODS组中NF-κB蛋白的表达较对照组明显升高，分布均一，胞质和胞核中均见表达。治疗组中大鼠小肠肌层中的NF-κB蛋白表达较MODS组明显减少，仅在部分细胞的胞核周围及胞核中有少量表达（图2）。

2.5 HSP70蛋白在大鼠小肠肌层中的表达 对照组大鼠小肠肌层偶见少量HSP70蛋白的表达。MODS组平滑肌胞浆中可见大量分布均匀的HSP70蛋白表达，较对照组明显升高，部分细胞核中亦见表达。治疗组中HSP70的表达较MODS组明显减少，其中环层肌减少尤为明显，仅在近黏膜面可见少量HSP70蛋白的聚集，偶见胞核中表达（图3）。

2.6 统计分析结果 3组大鼠小肠肌层COX-2、NF-κB和HSP70蛋白表达检测结果（表1）。

图1 免疫组化检测不同组别大鼠小肠肌层COX-2蛋白表达变化（×400）

图2 免疫组化检测不同组别大鼠小肠肌层NF-κB蛋白表达变化（×400）

图3 免疫组化检测不同组别大鼠小肠肌层HSP70蛋白表达变化（×400）

表1 小肠肌层COX-2、NF-κB和HSP70蛋白表达的IOD值检测结果比较（±s）

表1 小肠肌层COX-2、NF-κB和HSP70蛋白表达的IOD值检测结果比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与MODS组比较，bP＜0.05

组别对照组MODS组DCQD组n 20 17 29 COX-2 6767.86±2165.56 23 759.51±5725.66a 12 825.01±2711.27b NF-κB 1336.34±251.88 2138.95±583.09a 1629.62±321.69b HSP70 849.72±152.46 1781.15±326.85a 1056.72±181.62b

3 讨论

MODS是腹部外科患者死亡的重要病因。目前认为，胃肠道是MODS的始发部位，而胃肠动力障碍则是促发MODS的始动因素。胃肠道是人体内最大的储菌库。当腹腔重度感染，炎症反应刺激胃肠平滑肌，使得消化道蠕动减弱，肠内容物驱动停止、菌群失调、发酵产气，肠内压力增大，黏膜血流减少和破损，肠内细菌及代谢产物透过黏膜屏障进入血液循环，最终诱发MODS。因此，促进胃肠动力的恢复，可以有效地防治MODS的发生发展。

NF-κB是一组转录因子蛋白，对参与炎症反应的基因具有调控作用［2］。NF-κB被认为在炎症反应中发挥中心调控作用，因此已成为抗炎治疗的新热点。生理状态下，NF-κB主要以P50/P65组成的二聚体形式存在于胞质中，并与抑制性蛋白IκB结合，呈无活性状态［3］。应激状态下，LPS、TNF-α、IL-1β等外源性刺激可以经p38MAPK信号通路的激活，诱导促炎因子COX-2的过量表达［4］，而NF-κB是COX-2下游的重要靶标［5］。COX-2的过度表达通过激活NIK（NF-κB-inducing kinase），最终导致IκB的磷酸化、降解并脱离NF-κB。NF-κB移位至胞核，与靶基因的NF-κB结合位点相结合，启动基因转录［6］。其中含p65的二聚体具有显著的促炎活性，可以刺激巨噬细胞表达黏附分子，介导炎性细胞的移行及黏附［7］。同时，COX-2还是催化花生四烯酸生成前列腺素E2的限速酶，而后者是重要的炎性介质，可以产生氧自由基和活性氧，诱发炎症级联反应和组织损伤。本研究显示，在MODS状态下，大鼠小肠肌层中的COX-2和NF-κB蛋白表达均较对照组明显升高，而大承气汤则显示出明显的抑制作用。提示大承气汤促进MODS胃肠动力的恢复，可能与其抑制COX-2/NF-κB促炎信号的表达有着密切关系。

HSP是机体在损伤因素作用下所产生的一组高度保守的应激性蛋白质，通过分子伴侣机制发挥细胞保护作用。其中HSP70是含量最多的一种，具有抑制细胞凋亡，减轻炎症损伤的作用。研究发现，HSP70可以通过抑制JNK/Bim通路而抑制紫外线诱导的细胞凋亡［8］。另外，HSP70可以通过稳定Bcl-2蛋白，从而对抗线粒体氧化应激介导的细胞凋亡［9］。HSP70还可以通过激活蛋白激酶C，促进ATP水解和具有清除氧自由基的超氧化物歧化酶的生成，产生抗氧化作用，从而保护细胞。内毒素血症时，HSP70可以抑制NF-κB的活性［10］，及iNOS的表达，阻碍炎症反应的进一步发展。有研究发现，缺血再灌注损伤可以诱导HSP70的表达［11］。提示在应激状态下，细胞通过上调HSP-70的表达，抑制应激激酶的激活和细胞炎症反应及凋亡的加剧，从而发挥自身保护性。研究已证实，HSP在保护肠黏膜上皮中具有重要作用［12］。本研究提示，HSP70在小肠肌层中也发挥应激保护作用。MODS状态下，小肠肌层中的HSP70表达明显上调，且部分平滑肌细胞核中也可见表达，提示应激损伤诱导小肠平滑肌大量表达HSP70，在胞浆和胞核中同时发挥保护作用，减轻平滑肌细胞的进一步损伤。而大承气汤可使MODS大鼠小肠平滑肌HSP70表达明显减少，提示大承气汤可以明显减轻小肠平滑肌的应激损伤，促进胃肠动力的恢复。

本研究亦发现，大承气汤对MODS小肠环层肌COX-2蛋白表达的抑制作用强于纵层肌。这可能与COX-2上游激活因子及其受体在纵层肌和环层肌分布的差异性有关，但具体机制目前尚不清楚。另外，COX-2、NF-κB在细胞凋亡通路中亦发挥作用［13］，MODS状态下小肠平滑肌是否也发生了凋亡现象，而大承气汤又有无影响作用，还需要进一步的研究。

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