坎地沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞Nephrin、Podocin和CD2AP表达的影响

李秋月， 李六生， 李桂霞， 周 静， 吕金雷

1 南昌大学第一附属医院肾内科，南昌 330006

2 南昌大学医学院图书馆，南昌 330006

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的主要并发症之一，早期干预治疗对延缓糖尿病肾病的进展有重要作用。研究表明足细胞损伤在糖尿病肾病发病机制中起十分重要作用［1］，Nephrin、Podocin、CD2 相关蛋白（CD2AP）是足细胞裂孔膜上重要的跨膜糖蛋白，在维持足突裂孔膜结构完整中共同起重要作用，参与肾小球滤过屏障的形成并维持其正常功能［2］。因此，防止足细胞损伤是防治糖尿病肾病、肾功能损害的重要环节。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD 大鼠36 只，体重200～300g，由南昌大学医学院动物科学部提供。1.1.2 试剂与仪器 坎地沙坦（Candesartan，重庆圣华曦药业有限公司提供），链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司提供），Trizol试剂（美国Invitrogen 公司），逆转录试剂盒（加拿大MBI Fermentas公司），DNA 纯化试剂盒、Nephrin、Podocin、CD2AP 及βactin试剂及引物（上海生工生物工程技术服务有限公司），PCR 热循环仪（日本Techne公司）。

1.2 实验动物分组

SD 大鼠36只，随机分为3组，每组12只：A 组为正常对照组，B 组为DN 组，C 组为DN＋坎地沙坦组。B、C组给予高糖高脂饮食1个月后，于尾静脉注射STZ，以随机血糖≥16.7mmol／L 为糖尿病大鼠模型制备成功。于糖尿病模型成模1周后将3组大鼠分别置入代谢笼中喂养，C 组给予坎地沙坦5mg／（kg·d）灌胃，A 组及B组给予等量生理盐水灌胃。

1.3 标本收集与处理

各组大鼠于用药的第4周和第7周代谢笼收集24h尿液，用磺基水杨酸法检测24h尿蛋白定量，全自动生化分析仪检测血肌酐、尿肌酐，并根据以下公式计算Ccr：Ccr＝［尿肌酐浓度（μmol／L）×每分钟尿量（mL／min）］／［血肌酐浓度（μmol／L）×体重（kg）］

1.4 RT－PCR检测Nephrin、Podocin及CD2AP mRNA的水平

采用Trizol法，取肾组织100mg加1mL Trizol Reagent，匀浆后加入200μL 氯仿，离心后吸取上清，加入500μL异丙醇，离心沉淀后弃上清，70%乙醇洗沉淀，将RNA 溶于DEPC水，用紫外线分光光度计测定RNA 浓度及纯度。扩增引物序列如下：Nephrin 上游引物5′－CGGAGAAGACTGAGGCGC－3′，下游引物5′－TCACACCAGATGTCCCCTCAG－3′；Podocin 上游引物5′－TCTTGTCCTCTCCTCCCTGA－3′，下游引物5′－AGACGGAGGTCAACCTTGTG－3′；CD2AP 上游引物5′－GCTGGTGGAAAGGTGAACTG－3′，下游引物5′－CATCTCTGTCTTCCGCCTTC－3′；β－actin 上游引物5′－CCAACCGTGAAAAGATGACC－3′，下游引物5′－CGAGAGGAGCAATGATCTTG－3′。Nephrin、Podocin和CD2AP的扩增体系如下：反转录产物（cDNA）4 μL，10×Buffer 1.8 μL，dNTP（10 mm／L）0.4μL，引物（10pmol／μL）lμL，Taq DNA聚合酶1μL，反应总体系20μL。Nephrin 反应条件：95℃预变性5min，然后95℃10s，55℃退火30 s，72℃延伸l min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，扩增片段长度459bp；Podocin反应条件：95℃预变性10min，然后95℃45s，60℃退火45s，72℃延伸l min，共30个循环，最后72℃延伸10min，扩增片段长度195bp；CD2AP 反应条件：95℃预变性10min，然后95℃45s，60℃退火45s，72℃延伸l min，共30个循环，最后72℃延伸10min，扩增片段长度192bp。PCR 产物4℃保存。将PCR 产物点样于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，30 min后紫外光灯下观察结果。将电泳后的凝胶放于Image tool图像处理系统获得各自产物的吸光度值，目的基因吸光度与内参照β－actin吸光度的比值即为目的基因mRNA 的半定量值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况及生化指标变化

4周时，与A 组相比，B 组大鼠血糖和24h 尿蛋白定量均明显升高，Ccr下降，体重减轻（均P＜0.05）；与B组相比，C组的24h尿蛋白定量减少（P＜0.05），Ccr无明显差异（P＞0.05）。7周时，与A组相比，B组大鼠血糖、24h尿蛋白定量明显升高，Ccr下降，体重减轻（均P＜0.05）；与B 组相比，C组的24h尿蛋白定量减少，Ccr升高，体重增加（均P＜0.05）。见表1、表2。

表1 4周时各组大鼠生化指标检测结果（±s，n＝12）Table 1 The biochemical results in different groups at the 4th week（±s，n＝12）

表1 4周时各组大鼠生化指标检测结果（±s，n＝12）Table 1 The biochemical results in different groups at the 4th week（±s，n＝12）

＊P＜0.05 vs.group A；＃P＜0.05 vs.group B

Groups Weight（g）GLU（mmol／L）Proteinuria（mg／24h）Ccr（mL／min）A 241.22±21.24 6.38±0.92 7.00±0.59 1.75±0.34 B 199.41±15.54＊ 22.62±3.54＊ 28.67±3.83＊ 1.65±0.12＊C 212.74±23.19＊ 22.03±2.20＊ 24.00±3.68＊＃ 1.62±0.19＊

表2 7周时各组大鼠生化指标检测结果（±s，n＝12）Table 2 The biochemical results in different groups at the 7th week（±s，n＝12）

表2 7周时各组大鼠生化指标检测结果（±s，n＝12）Table 2 The biochemical results in different groups at the 7th week（±s，n＝12）

＊P＜0.05 vs.group A；＃P＜0.05 vs.group B

Groups Weight（g）GLU（mmol／L）Proteinuria（mg／24h）Ccr（mL／min）A 271.50±29.91 6.32±0.97 9.40±0.81 1.85±0.54 B 179.50±19.84＊ 23.83±2.40＊ 49.33±6.86＊ 1.08±0.43＊C 231.33±12.56＊＃23.30±2.35＊ 22.67±6.68＊＃ 1.50±0.27＊＃

2.2 各组大鼠Nephrin、Podocin和CD2AP mRNA半定量分析

将各组大鼠肾皮质组织匀浆后抽提其mRNA，用RT－PCR 方法测定Nephrin、Podocin和CD2AP mRNA 水平，其结果B 组条带亮度均低于A 组，C组经坎地沙坦干预治疗7周后，条带亮度逐渐增强。计算机定量分析后显示，与A 组比较，B 组Nephrin、Podocin 和CD2AP mRNA 表达下调（均P＜0.05）；与B 组比较，C 组Nephrin、Podocin 和CD2AP mRNA 表达上调（均P＜0.05）。见表3和图1。

表3 7周时各组大鼠Nephrin、Podocin和CD2AP的吸光度值（±s，n＝12）Table 3 The Avalues of Nephrin，Podocin and CD2AP in different groups at 7th week（±s，n＝12）

表3 7周时各组大鼠Nephrin、Podocin和CD2AP的吸光度值（±s，n＝12）Table 3 The Avalues of Nephrin，Podocin and CD2AP in different groups at 7th week（±s，n＝12）

＊P＜0.05 vs.group A；＃P＜0.05 vs.group B

Groups Nephrin Podocin CD2AP A 1.085±0.106 0.765±0.094 0.873±0.123 B 0.575±0.184＊ 0.460±0.090＊ 0.617±0.116＊C 0.892±0.169＃ 0.667±0.121＃ 0.768±0.088＃

图1 RT－PCR 方法检测各组大鼠Nephrin、Podocin、CD2AP mRNA 水平Fig.1 The expression levels of Nephrin，Podocin and CD2AP mRNA in different groups

2.3 各指标的相关性分析

2.3.1 24h 尿蛋白定量与Nephrin、Podocin 和CD2AP相关分析 采用直线相关分析后发现，24h时尿蛋白定量与肾组织Nephrin（r＝－0.48，P＜0.01）、Podocin（r＝－0.36，P＜0.01）和CD2AP（r＝－0.29，P＜0.01）表达呈负相关。见图2。

图2 24h尿蛋白定量与Nephrin、Podocin和CD2AP相关分析Fig.2 Relationship between 24hurinary protein and Nephrin，Podocin，CD2AP

2.3.2 Ccr与Nephrin、Podocin和CD2AP相关分析 采用直线相关分析后发现，Ccr 与肾组织Nephrin（r＝0.67，P＜0.01）、Podocin（r＝0.50，P＜0.05）和CD2AP（r＝0.48，P＜0.05）表达呈正相关。见图3。

图3 Ccr与Nephrin、Podocin和CD2AP相关分析Fig.3 Relationship between Ccr and Nephrin，Podocin，CD2AP

3 讨论

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的主要并发症之一，也是终末期肾衰竭的主要病因［3］，糖尿病肾病蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障的结构遭到破坏和（或）功能损伤有着十分密切的关系。肾小球滤过膜由脏层上皮细胞、基底膜（GBM）和内皮细胞组成，脏层上皮细胞即足细胞，构成防止蛋白丢失的最后一道屏障。2011年国际足细胞会议上有专家提出受损脱落的足细胞可能由肾小球Bowman囊壁层上皮细胞（PEC）延伸替代，杨婷等［4］发现PEC在局灶节段肾小球硬化、糖尿病肾病、IgA 肾病、缺血性肾病等疾病中有明显的增生分层。足细胞损伤与糖尿病肾病蛋白尿产生及肾小球硬化有关［5－6］。相邻足突之间的裂孔，由Nephrin、Podocin、CD2AP、FAT 和ZO－1等多种蛋白质分子（又称为裂孔膜分子或裂孔膜蛋白复合体）相连接，从而能阻止大分子物质通过，使得肾小球滤过膜对血浆中物质的通透具有高度选择性。足细胞裂孔隔膜上足细胞相关蛋白如Nephrin与Podocin表达及分布异常是糖尿病肾病蛋白尿发生的重要机制［7－8］。Fukasawa等［9］研究认为，裂孔膜蛋白可紧密连接足突和基底膜，使其不易从基底膜上脱落，而且足细胞还帮助基底膜清除免疫复合物和包曼氏囊内其他大分子物质［10］。Nephrin是一种跨膜蛋白，特异性表达在裂孔膜上，是裂孔膜蛋白复合体的主要成分，在糖尿病肾病的起始阶段，肥大的肾小球和Nephrin的低表达和蛋白尿密切相关［11］。Podocin也是一种跨膜蛋白，属Stomatin家族，原位杂交显示编码Podocin 的基因NPHS2几乎全部表达在肾小球足细胞，而不在其他组织部位表达［12］。Nephrin和Podocin表达下调所致足细胞的损害不仅和蛋白尿的程度有关，也与肾小球硬化症的进展和肾功能的损害有关［13］。CD2AP不仅在肾小球足细胞上有表达，在肾小管上皮细胞处也有微弱表达［14］。以上三者可能形成脂筏样结构发挥功能复合体的作用以维持裂孔膜结构和功能的完整性，且可促进或放大Nephrin诱导的信号传导［15］。研究发现，糖尿病肾病患者肾小球Nephrin 表达减少，引起足细胞损伤脱落，滤过屏障功能破坏，通透性增加，尿蛋白排出增加［16］。Wang等［17］通过检测糖尿病肾病患者尿沉渣中足细胞相关分子（Nephfin、Podocin 和Synaptopodin），发现其表达升高，应用血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）治疗后，尿液沉渣中Nephrin 排泄减少，且尿液中Podocin表达的改变可能与糖尿病肾病预后有关［18］。

本实验结果显示，糖尿病肾病大鼠足突间裂孔膜分子Nephrin、Podocin和CD2AP mNRA 表达均下调，一方面可能引起裂孔膜蛋白质复合体的组成发生改变，足突间的分子连接减少或中断，导致足突形态改变和产生蛋白尿；也有可能是高糖使足突融合甚至消失后，Nephrin、Podocin和CD2AP在足细胞表面的分布减少导致蛋白尿排泄增多；另一方面，Nephrin、Podocin在肾组织表达下调，使得细胞外到细胞内CD2AP及细胞骨架蛋白的信号传递发生障碍，足细胞结构进一步破坏，同时足细胞与基底膜相互作用减弱，铆钉于肾小球基底膜的足细胞松动，甚至从基底膜剥离、脱落，滤过膜的完整性遭到破坏导致蛋白尿产生。有研究证明，尿蛋白排泄量与足细胞数、Nephrin表达呈负相关，与足突宽度及血清肌酐浓度呈正相关［19］。本组研究对尿蛋白排泄量、肌酐清除率与足细胞相关分子多个定量参数表达等的相关性进行了分析发现，24h尿蛋白排泄量与肾组织Nephrin、Podocin、CD2AP 表达呈负相关，肌酐清除率与Nephrin、Podocin和CD2AP 表达呈正相关，说明足细胞作为肾小球滤过膜的重要结构和功能单位，在肾脏病的发生发展过程中起着重要作用。

坎地沙坦作为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）除了能够改善糖尿病肾病血流动力学外，还可通过多种途径保护肾功能。大量证据已经证明，ARB类能够通过阻断肾素－血管紧张素－醛固酮系统从而减少糖尿病肾病尿蛋白排泄；此外，Mifsud等［20］研究发现Valsartan和Irbesartan可通过阻止Nephrin表达下调，从而减少蛋白尿，坎地沙坦是否具有同样的作用目前未见相关公开报道。我们采用坎地沙坦干预后，其结果表明坎地沙坦在阻止Nephrin mRNA 表达下调的作用与Valsartan等类似，此外坎地沙坦还能上调Podocin和CD2AP mRNA 在足细胞上的表达，提示坎地沙坦减轻糖尿病肾病蛋白尿的作用机制之一可能是通过上调足细胞相关分子的表达而实现的。另外我们发现4周和7周时B、C组血糖水平无明显差异，因而认为坎地沙坦对大鼠肾脏保护作用与调节糖代谢无关。

本研究证实了坎地沙坦能通过增加Nephrin、Podocin和CD2AP的表达阻止甚至逆转足细胞损伤，减少蛋白尿以减轻肾小球硬化及肾脏纤维化进程，从而有效地保护肾功能，改善糖尿病肾病的预后。

［1］ Ziyadeh F N，Wolf G.Pathogenesis of the podocytopathy and proteinuria in diabetic glomerulopathy［J］.Curr Diabetes Rev，2008，4（1）：39－45.

［2］ Lehtonen S，Ryan J J，Kudlicka K，et al.Cell junction－associated proteins IQGAPl，MAGI－2，CASK，spectrins，and alphaactinin are components of the nephrin multiprotein complex［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（28）：9814－9819.

［3］ Reddy G R，Kotlyarevska K，Ransom R F，et al.The podocyte and diabetes mellitus：is the podocyte the key to the origins of diabetic nephropathy？［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2008，17（1）：32－36.

［4］ 杨婷，何晓峰，王芳，等.单纯性肾小球Bowman囊弥漫性增厚病理特点［J］.华中科技大学学报：医学版，2010，39（6）：836－850.

［5］ 陈立平，周巧玲，欧阳春，等.罗格列酮对糖尿病肾病大鼠足细胞nephrin和podecin 表达的影响［J］.中华肾脏病杂志，2007，23（4）：263－264.

［6］ 陈立平，周巧玲，彭卫生，等.罗格列酮联合洛沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞的协同保护作用［J］.实用医学杂志，2007，23（8）：1124－1126.

［7］ Stitt－Cavanagh E，MacLeod L，Kennedy C.The podocyte in diabetic kidney disease［J］.ScientificWorldJournal，2009，9：1127－l139.

［8］ Eto N，Wada T，Inaqi R，et al.Podocyte protection by darbepoetin：preservation of the cytoskeleton and nephrin expression［J］.Kidney Int，2007，72（4）：455－463.

［9］ Fukasawa H，Bornheimer S，Kudlicka K，et al.Slit diaphragms contain tight junction proteins［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20（7）：1491－1503.

［10］ Barisoni L，Kopp J B.Update in podocyte biology：putting one’s best foot forward［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2003，12（3）：251－259.

［11］ Zhang Z，Zhang Y，Ning G，et al.Combination therapy with AT1blocker and vitamin D analog markedly ameliorates diabetic nephropathy：blockade of compensatory renin increase［J］.Proc Nail Acacl Sci USA，2008，105（41）：15896－15901.

［12］ Cooper M E，Mundel P，Boner G.Role of nephrin in renal disease including diabetic nephropathy［J］.Semin Nephrol，2002，22（5）：393－398.

［13］ 陈立平，周巧玲，彭卫生，等.足细胞超微结构及其相关分子表达变化在糖尿病肾病发病中的作用［J］.中南大学学报：医学版，2007，32（4）：620－625.

［14］ Palmen T，Lehtonen S，Ora A，et al.Interaction of endogenous nephrin and CD2associated protein in mouse epithelial M－l cell 1ine［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13（7）：1766－1772.

［15］ Yuan H，Takeuchi E，Salant D J.Podocyte slit－diaphragm protein nephrin is linked to the actin cytoskeleton［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002，282（4）：585－591.

［16］ Kienbacher C，Wober C，Zesch H E，et al.Clinical features，classification and prognosis of migraine and tension－type headache in children and adolescents：a long－term follow－up study［J］.Cephalalgia，2006，26（7）：820－830.

［17］ Wang G，Lai F M，Lai K B，et al.Messenger RNA expression of podocyte－associated molecules in the urinary sediment of patients with diabetic nephropathy［J］.Nephron Clin Pract，2007，106（4）：169－179.

［18］ Wang G，Lai F M，Lai K B，et al.Urinary messenger RNA expression of podocyte－associated molecules in patients with diabetic nephropathy treated by angiotensin－converting enzyme inhibitor and angiotensin receptor blocker［J］.Eur J Endocrinol，2008，158（3）：317－322.

［19］ White K E，Bilous R W，Diabiopsies Study Group.Structural alterations to the podocyte are related to proteinuria in type 2 diabetic patients［J］.Nephrol Dial Transplant，2004，19（6）：1437－1440.

［20］ Mifsud S A，Allen T J，Bertram J F，et al.Podocyte foot process broadening in experimental diabetic nephropathy：ameliorationwith renin－angiotensin blockade［J］.Diabetoloqia，2001，44（7）：878－882.