氧糖剥夺对体外培养大鼠星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响及机制＊

邱 瑾， 姚文龙， 张 玥， 邹姮婧， 燕 琳， 张传汉

华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，武汉 430030

Cdh1 是细胞周期末期促进复合物（anaphase promoting complex，APC）的调节亚基，在调控细胞增殖、糖代谢、胶质细胞迁移、轴突生长等多种细胞功能中都发挥着重要作用［1］。我们前期研究已发现，Cdh1蛋白在大鼠全脑缺血模型海马组织中表达下降，可能参与了脑缺血的发病机制［2］，但引起Cdh1蛋白表达下降的原因目前尚不明确。本实验旨在观察体外纯化培养星形胶质细胞氧糖剥夺（oxygen－glucose deprivation，OGD）后Cdh1蛋白的表达变化，及其是否与细胞外液葡萄糖含量有关，为进一步明确缺血缺氧性脑损伤的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 星形胶质细胞的体外纯化培养

根据McCarthy 等［3］报道的方法，取新生1～2 d SD 大鼠，75%乙醇消毒，无菌操作下取出全脑浸于4℃预冷D－hanks液中，用眼科镊快速剥除脑膜及小脑，夹取皮层置于另一玻璃皿中。仔细剪碎皮层组织后，离心弃上清，加入0.25%胰酶，吹打悬浮细胞团后，37℃消化15 min，中间间隔振荡离心管壁，促进细胞悬浮。终止消化后，离心弃上清，加入含10%胎牛血清（Gibco公司），青霉素100U／mL，链霉素100mg／mL的DMEM／F12（Gibco公司）培养液中，轻柔吹打制备单细胞悬液，200目细胞筛过滤，差速培养0.5h 后，取悬液种于新细胞培养瓶中，37℃温箱培养，平均3～4d换液。细胞培养7～10d后，于37℃恒温摇床250r／min 过夜，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞。0.25%胰酶消化后，接种于新细胞培养瓶中，继续培养7～10d后，重复纯化传代，得到成熟的星形胶质细胞。

1.2 实验分组及模型处理

①以1.5×105／cm2的密度接种星形胶质细胞于3.5cm 培养皿中，随机分为3组，每组6个培养皿，分别为对照组、氧糖剥夺1h复氧组、氧糖剥夺6 h复氧组。细胞接种3d后，参考Lee等［4］的方法，吸去细胞培养液，根据分组情况，以含糖或不含糖Earle’s平衡液（NaCl 117mmol／L，KCl 5.4mmol／L，CaCl21.8 mmol／L，NaHCO326 mmol／L，MgSO40.8 mmol／L，NaH2PO41.0 mmol／L，Glucose 5.6mmol／L）冲洗细胞2 遍以去除血清的影响，对照组加入2mL 含糖Earle’s平衡液，继续常氧培养，氧糖剥夺1h复氧组及氧糖剥夺6h复氧组每培养皿加入2mL不含糖Earle’s平衡液，放入密闭小室内，通入混合气体（5%CO2，95%N2）进行1h或6h的缺氧处理，随后更换为正常培养液，继续37℃培养48h后弃液，预冷PBS冲洗2遍，提取细胞总蛋白。

②同样以1.5×105／cm2的密度接种纯化的星形胶质细胞于3.5cm 培养皿中，随机分为对照组、氧糖剥夺6h组、单纯缺氧6h组，于接种细胞3d后，弃培养液并冲洗细胞后，对照组及单纯缺氧6h组每培养皿加入2mL含糖Earle’s平衡液，氧糖剥夺6h组每培养皿加入2mL 不含糖Earle’s平衡液，对照组常氧培养，氧糖剥夺6h组及单纯缺氧6h组进行缺氧处理，6h 后收集培养液上清，血糖仪（Roche公司）检测葡萄糖含量，同时将培养皿中细胞用预冷PBS冲洗2遍，提取总蛋白用于后续实验。

1.3 Western blot检测

以含PMSF（1μmol／L）的RIPA 裂解液冰上充分裂解细胞，收集裂解液于4℃离心收集上清，加入上样缓冲液，100℃蛋白变性10min。以β－actin为内参，取等量的蛋白质经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移蛋白至PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 室温慢摇封闭1h，以兔抗Cdh1多克隆抗体（北京奥维亚，1∶400），或兔抗Skp2 多克隆抗体（武汉博士德，1∶400）或小鼠抗β－actin单克隆抗体（武汉博士德，1∶400）4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗3遍后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（武汉博士德，1∶3 000），室温慢摇孵育1h，TBST 漂洗3遍后进行ECL 显色（Pierce 公司），凝胶成像分析系统（BIO－RAD公司）进行扫描照相。

1.4 统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件包进行分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组间的比较采用t检验，3组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同程度氧糖剥夺／复氧对星形胶质细胞Cdh1及Skp2蛋白表达的影响

如图1所示，体外培养的星形胶质细胞，氧糖剥夺1h或6h并复氧48h后，Cdh1蛋白表达均下降，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；氧糖剥夺1h或6h并复氧48h后，与对照组相比，星形胶质细胞中Skp2蛋白表达均增加（P＜0.05）；氧糖剥夺1h及6h复氧两组间差异无统计学意义。

图1 星形胶质细胞不同程度氧糖剥夺／复氧后Cdh1及Skp2蛋白的表达变化Fig.1 The change in the expression of Cdh1and Skp2in astrocytes after OGD／recovery

2.2 单纯缺氧及氧糖剥夺对星形胶质细胞Cdh1蛋白表达影响的比较

单纯缺氧6h后，体外培养的星形胶质细胞中Cdh1蛋白表达没有显著变化；氧糖剥夺6h后，星形胶质细胞中的Cdh1蛋白表达明显下降，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；氧糖剥夺6h与单纯缺氧6h引起的Cdh1蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 葡萄糖对缺氧后星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达的影响Fig.2 Effect of glucose on the expression of Cdh1in astrocytes after hypoxia

2.3 细胞外液葡萄糖6h摄取率的检测

含糖的Earle’s平衡液中葡萄糖初始含量为5.6mmol／L。常氧条件下，星形胶质细胞在含糖的Earle’s平衡液中培养6h后，培养液中葡萄糖含量为（4.09±0.52）mmol／L；缺氧条件下，用含糖的Earle’s平衡液培养星形胶质细胞6h后，培养液中葡萄糖含量为（4.40±0.38）mmol／L。两组培养液中葡萄糖含量均下降。计算细胞外液葡萄糖摄取率，缺氧组葡萄糖摄取率（21.43±6.74）%低于常氧组（26.98±9.21）%，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

3 讨论

Cdh1作为APC在中枢神经系统中重要的调节亚基，主要通过D－box、KEN box以及A－Box等特殊的结构域识别底物，形成APC－Cdh1－底物复合物，从而启动底物蛋白的泛素化降解［5－6］。探讨引起Cdh1在星形胶质细胞氧糖剥夺后表达变化的因素，对治疗缺血性脑损伤具有重要意义。

近年来研究发现，星形胶质细胞能耐受一定程度的缺氧，而神经元缺氧后极易损伤，可能与二者细胞内不同的Cdh1活性有关［7－8］。生理状态下，神经元细胞中Cdh1活性高于星形胶质细胞，Cdh1通过泛素化降解Pfkfb3，使神经元细胞中仅在mRNA水平能检测到Pfkfb3 表达，而在蛋白水平Pfkfb3完全消失。Pfkfb3可以产生果糖－2，6－二磷酸，是糖酵解限速酶磷酸果糖激酶－1（Phosphofructokinase－1，PKF－1）最有效的激活剂［9］。因此神经元在缺氧后难以通过糖酵解提供能量。相反，星形胶质细胞在缺氧后能够有效启动糖酵解，具有一定的缺氧耐受性，与细胞内Pfkfb3未被Cdh1完全降解有关，较低的Cdh1活性是在缺氧条件下能否启动糖酵解，继续提供能量的关键［7，10］。

中枢神经系统的葡萄糖主要储存于星形胶质细胞中。当体外纯化培养的星形胶质细胞，因缺少神经元缺氧损伤的信号刺激，能量供应负荷也同时下降，星形胶质细胞的缺氧耐受时间与体内实验有所不同。体外实验已有报道，完全氧糖剥夺1h复氧48～72h后，星形胶质细胞发生反应性增殖，活细胞数量上升，而在氧糖剥夺4h复氧48h后，检测到星形胶质细胞发生凋亡坏死，活细胞数量下降［11］。因此，本实验选择对比观察星形胶质细胞体外氧糖剥夺1h及6h，复氧48h后细胞内Cdh1蛋白的表达变化。结果显示，两组Cdh1 蛋白表达均下降，两组间差异无统计学意义。我们推测，氧糖剥夺后星形胶质细胞中Cdh1活性的进一步下调与大量激活的糖酵解有关，而这一变化不受缺氧时间长短的影响。

Skp2作为SCF复合物泛素化降解细胞周期相关蛋白途径的关键点，与细胞增殖与凋亡都有一定的关联［12］。同时，Skp2也是Cdh1泛素化降解的下游底物之一［13］。我们前期的体内实验证明，大鼠全脑缺血模型海马组织中Cdh1 蛋白表达下降，而Skp2蛋白表达上升，提示Skp2参与了缺血性脑损伤发生机制，其表达增加可能与Cdh1活性下降有关［2，14］。本实验中也发现，与氧糖剥夺后星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达下降相对应的，Skp2蛋白表达明显增加，再次证实了前述推测。

体外氧糖剥夺／复氧模型中，涉及了氧糖剥夺、复氧两个阶段，为进一步明确引起Cdh1蛋白变化的具体机制，我们在星形胶质细胞氧糖剥夺6h后，立即检测细胞内Cdh1 蛋白的表达变化。结果显示，与对照组相比，Cdh1 蛋白表达明显下降，说明Cdh1蛋白的表达变化参与的是氧糖剥夺的损伤机制。而在单纯缺氧6h组，细胞外液持续供应葡萄糖的情况下，Cdh1蛋白表达并没有发生显著变化，与氧糖剥夺6h引起的Cdh1蛋白表达下降相比，二者差异有统计学意义。因此我们推测，细胞外液中是否存在持续供应的葡萄糖，与缺氧后Cdh1蛋白表达下降有着密切联系。为验证细胞外液中的葡萄糖在缺氧后继续参与了细胞代谢，我们对比了常氧培养6h及缺氧培养6h细胞外液中葡萄糖含量的变化。结果显示，即使在缺氧环境中，细胞外液中的葡萄糖依旧被摄取进入细胞内，但其摄取率低于常氧情况下。

综上可知，氧糖剥夺后星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达下降，Skp2蛋白表达增加，与体内模型中结果一致，其变化不受氧糖剥夺程度的影响而改变；氧糖剥夺引起的星形胶质细胞内Cdh1蛋白表达下降可能与细胞外液中缺少葡萄糖有关，但其具体机制仍需进一步研究。

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