骨形态发生蛋白2介导甲状旁腺素促进成骨细胞分化的实验研究

徐 莹 田 野 孟凌新

骨形态发生蛋白2介导甲状旁腺素促进成骨细胞分化的实验研究

徐 莹＊田 野1孟凌新

（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，1中国医科大学附属盛京医院脊柱关节骨科，沈阳110004）

目的 探讨骨形态发生蛋白2（BMP2）在甲状旁腺素（PTH）促进成骨细胞分化过程中的重要介导作用。方法培养 MC3T3-E1细胞，分为4组：1）盐水对照组；2）PTH 组；3）6-［4-［2-（1-哌啶基）乙氧基］苯基］-3-（4-吡啶基）吡唑并［1，5-a］嘧啶 （Dorsomorphin）组；4）PTH＋Dorsomorphin组。Real-time PCR法和 Westernblot方法检测细胞BMP2、BMP2下游基因和成骨因子的表达，碱性磷酸酶（ALP）染色方法检测细胞ALP的活性；双荧光素酶报告基因检测方法检测12xSBE-OC荧光素酶的活性。结果 ：PTH组BMP-2、成骨因子的表达及其12xSBE-OC荧光素酶的活性，明显高于盐水对照组。Dorsomorphin组和PTH＋Dorsomorphin组BMP-2、BMP-2下游基因和成骨因子的表达，均明显低于盐水对照组；但其表达于两组间无明显差别。结论 BMP2介导PTH促进成骨细胞的分化，PTH可通过上调BMP2的表达，提高其功能，促进成骨细胞的成熟分化。

甲状旁腺素；成骨细胞；骨形态发生蛋白2；分化

骨质疏松症在临床上是常见疾病，严重的骨质疏松症是骨折的高危因素之一，也经常是难治性疼痛的病因。目前治疗骨质疏松症的药物较多，甲状旁腺素（PTH）是近年来开始应用的药物［1］，其在人体内调节骨代谢方面发挥着重要的作用［2-5］。有研究表明，间歇给予PTH可以显著提高骨密度和骨强度［6］，而这种提高与PTH能增强成骨细胞的活力与分化作用的功能是分不开的［7］。对于PTH此种作用的机制，目前不甚明了。本研究拟通过PTH处理MC3T3-E1细胞，利用基因、蛋白检测、染色和转染等项技术，在细胞分子水平阐明PTH促进成骨细胞分化的作用机制。

材料和方法

1.细胞系和主要试剂

MC3T3-E1细胞系由美国罗切斯特大学骨关节中心赠送，这种细胞为早期小鼠成骨细胞，可诱导分化为成熟成骨细胞，目前广泛应用于有关成骨细胞的实验当中；1-34重组人甲状旁腺素（Sigma公司）；α-MEM 培养基（Gibco公司）；BMP信号通路抑制剂 Dorsomorphin （Tocris bioscience）；碱性磷酸酶（ALP）染色one-step试剂（Pierce公司）；RNeasy试剂盒（Qiagen公司）；逆转录试剂盒（Invitrogen公司）；SYBR Green（Applied Biosystems公司）；ALP兔抗 鼠 单 克 隆 抗 体 （santa cruz biotechnology 公司）；Runx2兔抗鼠单克隆抗体（abcam 公司）；Osteocalcin（OC）兔抗鼠单克隆抗体（santa cruz biotechnology公司）；β-actin兔抗鼠单克隆抗体（Sigma公司）。

2.方法

2.1 细胞培养和分组

MC3T3-E1细胞生长于α-MEM 培养液中，内加10%胎牛血清、1%青霉素／庆大霉素溶液、5mM L-Glutamine，置于37℃、5%CO2，饱和湿度培养箱中孵育，至细胞70%-80%融合时，开始处理。

实验分组：

盐水对照组：0.9%生理盐水处理细胞，给药方式同PTH；

PTH 组：10-8M PTH 处理细胞，6h后更换培养液，48h为1个循环，共3个循环；

Dorsomorphin组：10-8MDorsomorphin 处理细胞，给药方式同PTH；

PTH＋Dorsomorphin组：以上浓度PTH和Dorsomorphin同时处理细胞，给药方式同PTH。

2.2 转染实验

将MC3T3-E1细胞种植于6孔培养皿中，至细胞70%-80%融合，以12xSBE-OC荧光素酶质粒和SV-40Renilla荧光素酶质粒共转染细胞；转染24h后，以PTH处理细胞6h；然后用双荧光素酶报告基因检测的方法，以SV-40Renilla荧光素酶为内参，检测12xSBE-OC荧光素酶的活性。

2.3 RNA 提取和 Real-time PCR

用RNeasy试剂盒提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，然后稀释3倍，取1μl稀释后的cDNA进行Real-time PCR反应。特异性小鼠引物序列如下：ALP：Sense：TGACCTTCTCTCCTCCATCC，Antisense：CTTCCTGGGAGTCTCATCCT； Runx2： Sense： GGAATGATGAGAACTA，Antisense：ACCGTCCACTGTCACTTT； OC： Sense： TGCTTGTGACGAGCTATCAG， Antisense： GAGGA-CAGGGAGGATCAAGT；BMP2：Sense：ATATGCTAGATCTGTACCGC， Antisense： CTCATCTCTGGAAGTTCCTC； β-actin： Sense：AGATGTGGATCAGCAAGCAG； Antisense：GCGCAAGTTAGGTTTTGTCA.反应条件为：950C预变性15min后，950C变性20s，580C退火30s，720C延伸30s，共45个循环，于720C延伸阶段检测荧光产物，生成扩增曲线。在同一次反应中，各组均设3个平行重复。以 β-actin为内参基因，通过RotorGene分析软件进行定量分析。

2.4 碱性磷酸酶染色

吸除细胞培养液，PBS清洗2次，于室温以10%中性福尔马林固定细胞30min；吸除福尔马林，PBS清洗2次，加入 ALP one-step染色剂，于37°C孵育45min；吸除染色剂，PBS清洗2次，室温下自然干燥过夜。

2.5 Western Blot检测蛋白

各组MC3T3-E1细胞分别种植于直径10cm培养皿中，分别经不同处理后，以 Golden lysis buffer液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，每泳道上样40μg，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转至PVDF膜。加入一抗（1：1000）4°C孵育过夜，洗膜后，加入二抗（1：3000）室温下孵育1h。以 βactin为内参基因，Supersignal west Pico试剂孵育10min，曝光20s，照相并分析。

3.统计学处理

全部数据以均数＋标准差表示，用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用t检验和单因素方差分析；当P＜0.05时认为有统计学意义。

结 果

1.PTH对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

通过Real-time PCR，我们首先观察了经PTH连续处理24h细胞的ALP、OC和Runx2等成骨因子的变化，可以看到于2h时，PTH即显著促进MC3T3-E1细胞成骨因子的表达（P＜0.05），于6h时达到峰值（P＜0.05），随后逐渐下降，于24h时，部分成骨因子在盐水对照组与PTH组间，已无统计学差别（P＞0.05）（图1）。基于以上结果，我们于PTH处理细胞6h后，更换培养液，48h为1个循环，共3个循环，然后进行ALP染色和Westernblot实验。ALP染色结果显示，细胞的染色深度随时间均逐渐增强，在经PTH处理后2、4和6日后，PTH组的细胞染色深度均明显强于盐水对照组（图4）；Westernblot结果进一步显示，于PTH处理后6日，ALP、OC和Runx2等成骨因子的蛋白表达量也明显增加（图5）。以上结果表明，PTH可以显著提高成骨细胞成骨因子的基因表达和蛋白合成，从而促进成骨细胞的分化。

图1 PTH作用24h内对各成骨因子mRNA表达的影响Fig.1 The mRNA level of osteoblastic genes was increased by PTH treatment in 24h.＊代表与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。

图2 PTH对12xSBE-OC荧光素酶活性的影响＊代表与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。Fig.2 12xSBE-OC Luciferase activity was enhanced by PTH treatment

2.PTH对 MC3T3-E1细胞中BMP2表达及其信号通路的影响

Real-time PCR 显 示，经 PTH 处 理 后，BMP2的表达显著提高；同时其表达也于PTH处理后6h，达到峰值，24h后逐渐下降（图1）。为进一步验证PTH对 MC3T3-E1细胞中BMP2信号通路的影响，我们进行了转染试验；结果显示，12xSBE-OC荧光素酶的活性，在PTH组显著高于对照组（P＜0.05）（图2）。以上数据表明，PTH不但提高了成骨细胞中BMP2的表达量，同时也增强了BMP2信号通路的功能。

图3 Dorsomorphin对BMP2及其下游基因的影响＊与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）；＃与Dorsomorphin组相比有统计学意义（P＜0.05）。Fig.3 BMP2and its downstream gene expression was inhibited byDorsomorphin

为进一步验证BMP2在PTH促进成骨细胞分化过程中，是否具有介导作用，我们应用BMP信号通路抑制剂Dorsomorphin处理细胞。Real-time PCR显示，经Dorsomorphin处理后的细胞，其BMP2及其下位基因ID1和PTCH1的表达，与盐水对照组相比明显降低（P＜0.05）；而Dorsomorphin组和PTH＋Dorsomorphin组间，则无统计学差别（P＞0.05）（图3）。这表明Dorsomorphin明显抑制了BMP2的表达和BMP信号通路的功能，且PTH不能逆转此种抑制作用。在BMP2的表达被抑制后，我们利用碱性磷酸酶染色和 Westernblot法，检测了细胞内ALP、OC和Runx2等成骨因子蛋白的表达；结果显示，Dorsomorphin组和PTH＋Dorsomorphin的蛋白条带深度和染色强度，都明显弱于对照组；而Dorsomorphin组和PTH＋Dorsomorphin组间，则无明显差别（图4、5）。以上结果表明，在成骨细胞中BMP2的表达被抑制后，PTH则丧失了其提高细胞中成骨因子表达的作用。

讨 论

PTH目前用于治疗具有高危骨折因素的骨质疏松症病人，间歇给与PTH可以明显促进此种病人的骨质形成［8］。同时，PTH能够在所有骨质界面促进骨形成，提高骨小梁的连接和骨皮质的厚度，从而改善骨质的结构和强度［9］。Alkhiary等通过股骨骨折动物模型研究认为，小量给与PTH，可以显著提高骨折处骨痂的体积，强度和抗扭转力量［10］；Manabe等则证实，与对照组相比，PTH组的骨痂更加成熟，其矿化水平也优于对照组［11］。

有研究表明，PTH的成骨作用是与其促进成骨细胞及其成骨前体细胞的增殖和分化作用分不开的［7］。本研究中，在给与PTH后，我们也检测到细胞内成骨因子的表达显著提高，这与以往的研究结果非常一致，这一研究结果也促使我们进一步探索PTH成骨作用的机制。应该说目前对于PTH促进成骨细胞分化的作用机制，研究较多。当PTH与其受体结合后，PTH受体与G蛋白和腺苷环化酶相互作用，产生cAMP，通过磷酸化作用活化了蛋白激酶C［12］。但是此种通路并非PTH发挥作用的唯一通路。利用基因微量检测技术证实，在PTH促进成骨细胞分化的过程中，也可以通过提高卷曲蛋白1（frizzled-1，FZD-1）的表达和降低轴蛋白（axin）的表达来实现［13］。另外，Smad3可能也与诱导β-catenin表达，参与PTH促进成骨分化的作用有关［14］。

在这些促进成骨分化的信号通路中，BMP2是目前比较公认的重要因子。BMP2是骨形态发生蛋白家族中活性和功能最强的因子之一，其在骨发生、骨诱导、骨修复和骨量保持等方面发挥着关键性的作用［15］。有 研 究 表 明，PTH 能 够 明 显 提 高MC3T3-E1细胞中BMP2mRNA 的表达［16］；也能够显著增强BMP2蛋白的活性和功能［17］。近年来的研究证实，BMP2与PTH在成骨细胞分化的过程，发挥着协同的作用［18］。

因此我们设想，BMP2可能在PTH促进成骨细胞分化的过程中，发挥着重要的介导作用。通过Real-time PCR和转染技术，我们证明了PTH促进成骨细胞分化的作用，同时也表明，PTH也可以提高BMP2的基因表达，增强BMP2信号通路的功能。更重要的是，当BMP2信号通路的功能被抑制后，PTH的促进成骨细胞成熟分化的功能也在一定程度上出现了抑制现象。我们的实验数据和结果表明，BMP2在PTH促进成骨细胞成熟分化的过程中发挥着重要的作用，PTH通过提高BMP2的表达和功能，以发挥其促成骨分化的作用。

综上所述，我们认为BMP2在PTH促进成骨细胞成熟分化的过程中具有重要的介导作用；这一发现也在细胞分子水平，阐明了PTH促进成骨细胞分化的部分机制，为临床骨质疏松症的PTH治疗，提供了一定的理论基础和依据。

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Parathyroid hormone stimulate osteoblast differentiation by up-regulation of BMP2 expression and function

Xu Ying＊，Tian Ye1，Meng Lingxin
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital of China Medical University，1Department of Orthopaedics，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang110004，China）

ObjectiveTo study the important role of BMP2in the PTH-induced osteoblast differentiation.MethodsMC3T3-E1cells were divided into 4groups：1）Controls；2）PTH treatment；3）Dorsomorphin treatment；4）PTH＋Dorsomorphin treatment.Gene and protein expression levels of BMP2，BMP2downstream genes and osteoblastic genes and protein expressions were detected by Real-time PCR and Western blot respeetively.Alkaline phosphatase（ALP）staining was performed to detect ALP activity.12xSBE-OC luciferase activity was measured using dual luciferase reporter assays.ResultsThe expression level of BMP2and osteoblastic marker genes was higher in the PTH group than in controls.PTH also increases 12xSBE-OC luciferase activity significantly.In the other hand，the expression of BMP2，BMP2 downstream genes and osteoblastic genes was lower in Dorsomorphin and PTH＋Dorsomorphin group，than in controls.However，the expression was similar in Dorsomorphin and PTH＋Dorsomorphin groups.ConclusionPTH stimulates osteoblast differentiation by up-regulating BMP2expression and function.

Parathyroid Hormone；Osteoblast；BMP2；Differentiation

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.017

2011-08-15

2011-10-12

徐莹，女（1977年），汉族，讲师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）