Bmi-1和EZH2基因在小细胞肺癌中的表达及其意义

唐 甜 陕 光

Bmi-1和EZH2基因在小细胞肺癌中的表达及其意义

唐 甜1陕 光2＊

（1武汉大学人民医院肿瘤Ⅱ科；2武汉大学人民医院泌尿Ⅱ科 武汉430060）

目的 探讨Bmi-1和EZH2基因在小细胞肺癌中的表达及其意义。方法 收集武汉大学人民医院病理科2006-2009年非小细胞肺癌存档蜡块40例，采用免疫组织化学S-P法检测40例非小细胞肺癌及癌旁组织中Bmi-1和EZH2基因的表达水平，并采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对Bmi-1和EZH2基因的表达进行定量分析，用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验。结果 1.Bmi-1在非小细胞肺癌中呈高表达，癌旁组织中呈低表达。非小细胞肺癌组织Bm i-1的表达明显高于癌旁组织，差异有显著性（P＜0.05）。2.EZH2基因的表达EZH2基因在非小细胞肺癌中呈高表达，癌旁组织中呈低表达。非小细胞肺癌组织中EZH2基因的表达明显高于癌旁组织（P＜0.05）。结论 EZH2和Bmi-1基因对肺癌的生长有着不同的调节作用，在肺癌的发生、发展中发挥重要的作用。

非小细胞肺癌（NSCLC）；Bmi-1；EZH2基因；免疫组织化学

EZH2基因和Bmi-1基因同属于Polycomb group（PcG）家族，但两者分属于不同PcG蛋白复合体，两基因都被认为是肿瘤干细胞之一，在调节肿瘤细胞周期的发生发展中有重要作用。EZH2和Bmi-1基因通过对染色体的修饰作用而维持同源盒（HOX）基因的沉默状态，并调节和控制着细胞的转录［1-3］，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。

本研究采用免疫组织化学方法检测了EZH2和Bmi-1的表达，探讨EZH2和Bmi-1与肺癌的关系，阐明它们在肺癌的发生发展中的作用，为指导肿瘤治疗提供实验依据。

材料和方法

1.材料

1.1 病例资料和分组

收集武汉大学人民医院2006-2009年临床手术切取（病理切片诊断）的非小细胞肺癌40例，另取瘤组织周围正常肺组织5例作对照。其中男28例，女12例，年龄41-76岁，中位年龄58.5岁。组织学分类：腺癌20例，鳞癌16例，腺鳞癌4例。病理分级：Ⅰ级（高分化）13例，Ⅱ级（中分化）18例，Ⅲ级（低分化）9例。临床分期（TNM分期）：Ⅰ期13例，Ⅱ期20例，Ⅲ期7例，其中颈淋巴结转移20例，非颈淋巴结转移20例，均为术中所见和术后病理证实。所有病例术前均未行放、化疗。

2.主要试剂和仪器

2.1 主要试剂

浓缩型鼠抗人EZH2单克隆抗体、浓缩型鼠抗人Bmi-1单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司），S-P通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

2.2 主要仪器

YWY781型医用微波仪，250W，50Hz，浙江临安电子器材厂生产。

3.方法

3.1 免疫组织化学S-P法检测EZH2、Bmi-1

5μm组织切片常规脱蜡、脱水，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，EZH2、Bmi-1采用微波抗原修复（3档，10min），正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗37℃孵育1.5h，生物素标记的二抗处理10min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理10min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，已知阳性乳腺癌组织作为EZH2、Bmi-1的阳性对照组。

3.2 免疫组织化学结果判断

（1）EZH2、Bmi-1以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。（2）采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对EZH2、Bmi-1抗原的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

4.统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q检验，所有数据均采用SPSS11.5统计软件进行处理。

结 果

1.HE染色

非小细胞肺癌组织中可见瘤细胞排列成菊形团、彩带样、条索状、腺管样，瘤细胞排列密集，核深染（图1）。癌旁组织中可见肺组织结构正常，并可见结构正常的肺泡（图2）。

2.EZH2的表达

非小细胞肺癌组织中可见较多棕黄色颗粒，EZH2呈阳性表达（图3）；癌旁组织中可见极少量的棕黄色颗粒，EZH2呈阴性表达（图4）。

二组样本的阳性面积率和平均光密度的图像分析结果见表1。经单因素方差分析，二组样本EZH2的表达差异有显著性意义（P＜0.05）。经SNK（q）检验，非小细胞肺癌与癌旁组织的阳性面积率和平均光密度的差异有显著性意义（P＜0.05）。

表1 EZH2在非小细胞肺癌及癌旁组织中的阳性面积率和平均光密度的表达（¯x±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of EZH2 in NSCLC and in Cancer side tissue（¯x±s）

3.Bmi-1的表达

非小细胞肺癌组织中可见密集分布的棕黄色颗粒，Bmi-1呈阳性表达（图5）；癌旁组织中可见少量的棕黄色颗粒，Bmi-1呈阴性表达（图6）。二组样本的阳性面积率和平均光密度的图像分析结果见表2。经单因素方差分析，二组样本Bmi-1的表达差异有显著性意义（P＜0.05）。经SNK（q）检验，非小细胞肺癌与癌旁组织Bmi-1的阳性面积率和平均光密度的差异有显著性意义（P＜0.05）。

表2 Bmi-1在非小细胞肺癌及癌旁组织中的阳性面积率和平均光密度的表（¯x±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of Bmi-1 in NSCLC and in Cancer side tissue（¯x±s）

讨 论

肺癌的发生、发展是各种原因使原癌基因激活，抑癌基因失活从而使细胞增殖和凋亡失调所致。EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）基因和 Bmi-1（B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1）基因同属于Polycombgroup（PcG）家族，但两者分属于不同PcG蛋白复合体，两基因被认为是肿瘤干细胞之一，通过调节细胞周期在肿瘤的发生发展中其重要作用。基因转录系统的失调，无论是基因的过度激活，还是基因的过度抑制，均可导致肿瘤的发生［4］。目前有研究已表明EZH2和Bmi-1在人类许多恶性肿瘤中有过高的表达。Collett等［5］利用组织芯片技术分析190例乳腺癌患者，结果显示EZH2的表达与 Ki-67正相关，说明EZH2在促进癌细胞增殖具有重要作用。这些结果说明EZH2可作为肿瘤标志物监测乳腺癌的演变，临床上可通过监测EZH2水平来判断乳腺癌患者的预后及制定治疗策略。提示EZH2在肿瘤的发生发展中起着重要作用，可作为检测肿瘤预后的重要指标之一。Simon JA［6］等认为EZH2能够促进细胞的自我更新，并且阻止胚胎干细胞（ES cell）的分化，说明EZH2在肿瘤进展过程中有类似于干细胞的特性。研究表明Bmi-1是维持神经干细胞、造血干细胞、肿瘤干细胞等增殖所必须的一种重要基因，Bmi-1表达量的减少能明显使上述三种细胞的细胞增殖停滞，细胞衰老［7-9］。因而表明 Bmi-1在肿瘤的发展中起着非常重要的作用，提示其为一非常重要的原癌基因，在细胞分化、增殖等方面起重要作用［10-12］。

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的瘤细胞，具有自我更新的能力，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断增殖的源泉，越来越多的研究认为肿瘤是在干细胞水平上发生的［13-15］。所以，在肿瘤干细胞水平上进行靶基因的治疗非常重要，而EZH2和Bmi-1被认为是肿瘤干细胞基因，在肿瘤的发生发展中起着重要的［16-18］作用。

我们采用免疫组织化学方法检测了肺癌组织和癌旁组织中EZH2和Bmi-1的表达，结果显示：EZH2在癌旁组织中的表达量较低，而在肺癌组织中的表达量较高，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。提示EZH2作为肿瘤干细胞可能参与了肺癌发生的早期生物学事件，并在肿瘤的进程中起着重要的作用，其可能的机制是EZH2通过与EED形成EED-EZH2PcG蛋白复合物甲基化组蛋白H3的第27位赖氨酸（H3-K27）实现基因沉默，从而导致基因的高表达。同时我们还检测了Bmi-1基因在肺癌组织和癌旁组织中的表达，结果显示：Bmi-1基因在癌旁组织中的表达量较低，而在肺癌组织中的表达量较高，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。提示Bmi-1蛋白高表达是肿瘤患者预后差的一个危险因素，Bmi-1基因可通过抑制p16INK4a表达，延长细胞增殖期，阻止细胞凋亡；并可调节HOX基因的转录，进而参与细胞增殖及侵袭转移过程。研究提示Bmi-1和EZH2可能通过某些交叉点共同在恶性肿瘤的发生、发展中发挥作用，但其具体机制尚不清楚。深入研究Bmi-1和EZH2两者之间的关系对阐明肺癌的发生、发展并最终开发新的治疗手段提供理论依据。

肺癌的发生、发展是一个多基因、多阶段、多步骤渐进演化过程，该过程涉及到众多原癌基因的激活、肿瘤抑制基因的突变或失活、细胞凋亡机制紊乱、信号转导通路异常等多因素协同作用。近年来的研究发现EZH2和Bmi-1基因在许多肿瘤中都存在着过度表达，并与肿瘤的生物学行为有关。通过探讨EZH2和Bmi-1基因在肺癌中的表达，研究其与肺癌生物学行为之间的相关性，可为肺癌的早期诊断、肿瘤治疗、预后判断、复发监测提供新的途径。

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图 版 说 明

图1 非小细胞肺癌组织中可见瘤细胞排列成菊形团、彩带样、条索状、腺管样，瘤细胞排列密集，核深染（HE×200）。

图2 癌旁组织中可见肺组织结构正常，并可见结构正常的肺泡（HE×200）。

图3 EZH2的表达：非小细胞肺癌组织中可见较多棕黄色颗粒，EZH2呈阳性表达（S-P×200）。

图4 EZH2的表达：癌旁组织中可见极少量的棕黄色颗粒，EZH2呈阴性表达（S-P×200）。

图5 Bmi-1的表达：非小细胞肺癌组织中可见较多棕黄色颗粒，Bmi-1呈阳性表达（S-P×200）。

图6 Bmi-1的表达：癌旁组织中可见极少量的棕黄色颗粒，Bmi-1呈阴性表达（S-P×200）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The small cell lung cancer can seen the tumor cells arranged ChengJu form group、ribbons、sample of the cable from、the gland kind、tumor cells are arranged dense，nucles is hyperchromatic（HE×200）.

Fig.2 lung structure is normal in Cancer side tissue，and structure normal alveolar can be visibled（HE ×200）.

Fig.3 Expression of EZH2There were plenty of brown particles in the cytoplasm of nonsmall-cell lung cancer（NSCLC）.EZH2were Positive（S-P×200）.

Fig.4 Expression of EZH2Tere were few brown particles in the cytoplasm of normal lung tissue，EZH2were nega-tive（S-P×200）.

Fig.5 Expression of Bmi-1There were plenty of brown particles in the cytoplasm of nonsmall-cell lung cancer（NSCLC）.Bmi-1were Positive（S-P×200）.

Fig.6 Expression of Bmi-1Tere were few brown particles in the cytoplasm of normal lung tissue，Bmi-1were negative（S-P×200）.

Expression and significance of Bmi-1and EZH2in non-small-cell lung cancer

Tang Tian1，shan Guang2＊
（1Department of Oncology，Renmin Hospital of Wuhan University；2Department of Urology，Renmin Hospital of Wuhan university，Wuhan430060，China）

ObjectiveTo investigate the clinical significance and the expression of Bmi-1and EZH2in non-small-cell lung cancer （NSCLC）.MethodsSpecimens from 40cases （28males，and 12females）NSCLC were collected from the Department of Pathology in RenminHospital of Wuhan University from 2006to 2009.Expression of Bmi-1and EZH2were studied by immunohistochemical S-P staining in the 40 specimens of NSCLC and paracancerous tissues.The average optical density and positive area rates of Bm i-1and EZH2expression of were measured by image analysis（HPIAS-1000）.Results1.The expression of Bmi-1was high in NSCLC，but low in tissues，with a significantly difference tissue（P＜0.05）.2.The expression of EZH2was low in NSCLC.But high in paracancorous tissue，with a significantly difference（P＜0.05）.ConclusionBmi-1and EZH2have differente regulateing effects on the growth of lung cancer，and play important roles in the tuagensis and development of lung cancer.

NSCLC；Bmi-1；EZH2；Immunohistochemistry

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.011

2011-09-12

2011-12-01

唐甜，女（1981年），汉族，博士。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）