食管鳞状细胞癌中血管生成拟态及MMP-1蛋白的表达

柴大敏 鲍正齐 冯振中 马 莉 王丹娜 陶仪声

食管鳞状细胞癌中血管生成拟态及MMP-1蛋白的表达

柴大敏1＊鲍正齐2冯振中1马 莉1王丹娜1陶仪声1＊

（1蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室；2蚌埠医学院第一附属医院，蚌埠233030）

目的 研究人食管鳞状细胞癌（human esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中是否存在血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）及其与（Matrix metalloproteinase-1，MMP-1）表达的关系，以及 MMP-1过表达的临床意义。方法 收集118例食管鳞状细胞癌的标本，每例均有完整的临床资料，利用CD31（Platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM-1）和PAS套染观察是否存在VM，对VM组和对照组进行 MMP-1染色，分析VM与MMP-1表达的关系及 MMP-1表达与临床病理学参数的关系。结果 118例食管鳞状细胞癌组织中有34例（28.81%）存在VM，有VM生成组的 MMP-1过表达比例显著高于无VM组，两组之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。有淋巴结转移组的MMP-1过表达的比例显著高于无淋巴结转移组（P＜0.05）；浸润至深肌层及外膜层的 MMP-1过表达的比例显著高于浸润之粘膜层和浅肌层的（P＜0.05）；临床分期Ⅲ-Ⅳ期的MMP-1蛋白的过表达显著高于临床分期Ⅰ-Ⅱ期的（P＜0.05）。结论 食管鳞状细胞癌中存在VM，MMP-1的过表达可能促进VM形成；VM的存在和MMP-1过表达共同促进淋巴结转移和肿瘤浸润。

食管鳞状细胞癌；血管生成拟态；基质金属蛋白酶-1；免疫组化染色；转移

食管癌是由食管粘膜上皮或腺体发生的恶性肿瘤，在十大恶性肿瘤中居第四位。全世界每年有30万人死于食管癌，其中约一半发生于中国。组织学上包括鳞状细胞癌、腺癌等，其中以鳞状细胞癌最为多见，约占食管癌的90%。食管鳞状细胞癌早期症状不明显，且容易局部浸润、转移。很多研究显示MMP-1与肿瘤浸润、转移及血液供应有密切的关系［1-2］。目前许多关于肿瘤血供途径的研究主要集中在肿瘤血管生成（angiogenesis），即新生血管从瘤体附近组织向实体瘤定向出芽的过程。最近研究发现肿瘤血管生成并不是肿瘤获得血供的唯一微循环机制。在黑色素瘤、炎性乳腺癌、肝细胞性肝癌、胃恶性间质瘤、非小细胞肺癌［3-7］等高度侵袭性肿瘤中，发现一种不依赖于内皮细胞的肿瘤内血液供应模式--血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）：肿瘤细胞通过自身变形和基质重塑产生血管样通道而满足自身血液供应的方式。

本实验即通过CD34及PAS套染的方式观察食管鳞状细胞癌中是否存在VM，进一步研究VM与MMP-1之间的关系及其临床意义。

材料和方法

1.临床资料

随机挑选2007-2008年蚌埠医学院病理教研室食管鳞状细胞癌存档标本（石蜡包埋）118例，其中男85例，女33例；年龄为38-79岁（60.6±8.6）；组织学分级：高分化30例，中分化70例，低分化18例；浸润至粘膜层及浅肌层28例，深肌层及外膜层90例；淋巴结转移者52例，无转移者66例；临床分期Ⅰ-Ⅱ期32例，Ⅲ-Ⅳ期86例。所有患者术前均做过活检且无家族史，术后经3名以上病理学专家证实为鳞状细胞癌，且术前均未接受放化疗。

2.主要试剂

鼠抗人单克隆抗体CD34（MAB-0034），克隆系JC／TOA（即用型，6ml）和DAB显色试剂盒购自福州迈新公司；PAS染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗人单克隆抗体 MMP-1购自Neo-Markers公司（1：100稀释）。

3.CD31和PAS套染及VM结构观察

按照Elivision两步法操作，①免疫组化CD34步骤到DAB显色后，血管内皮着色后，水流冲洗1 min。②置于0.5%高碘酸中还原10min，水流冲洗。③置于Schiff液中10min，自来水冲洗。④蒸馏水返色10min。⑤苏木精复染细胞核，脱水，封片。

CD34和PAS套染的切片在显微镜下观察，肿瘤细胞围绕成管腔样结构，管壁没有CD34阳性、呈梭形的内皮细胞环绕，管腔内有红细胞，这样的管腔样结构判断为VM。管壁有CD34阳性的内皮细胞和PAS阳性的基底膜样结构，无论管腔内有无红细胞，均判定为内皮依赖性血管。

4.MMP-1免疫组化染色及结果判定

MMP-1（1：100），阳性对照为结肠癌，阴性对照为PBS代替一抗。免疫组化结果判定标准：阳性表达是细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒。采用双评分半定量法评分：①每张切片随机观察10个高倍视野，每个视野计数200个细胞；②阳性细胞﹤10%为0分，10-50为1分，51-75为2分，﹥75为3分；③细胞不着色为0分，浅黄为1分，黄色为2分，棕褐色为3分；④两者分数相乘0分为（-），2-3分为（＋），4-6分为（＋＋），＞6分为（＋＋＋）；≤3分为低表达，≥4分为过表达。

5.统计学处理

应用SPSS软件进行χ2检验，P＜0.05有统计学意义。

结 果

1.食管鳞状细胞癌中存在VM现象

实验发现118例食管鳞状细胞癌标本中有34存在VM。HE染色镜下这些管道样结构由肿瘤细胞围成，管道内有红细胞存在，红细胞被肿瘤细胞围绕。CD34和PAS套染可见一层PAS阳性的物质围城基底膜样结构分开肿瘤细胞和红细胞，这些围城管腔的肿瘤细胞CD34染色均为阴性，证实不是内皮细胞（图A），而CD34染色阳性的为内皮细胞依赖性血管（图B）。

2.MMP-1的表达情况与食管鳞状细胞癌患者临床病理参数的关系

整个上世纪80年代，全国东部沿海地区，特别是广东深圳地区都在开发开放的前沿。上海作为老工业基地，是国有经济比较重的一个地方，同时也是国家的财政口袋，整个中央财政的1/4是由上海财政上交的资金贡献的，上海相当于是改革开放的一个后卫，也因为此，整个80年代，上海经济社会发展总体比较慢。邓小平老人家在1990年这个关键的时候，推动了上海的浦东开发。老人家说过，深圳的开放是面对着香港的，珠海的开放是面对着澳门的，厦门的开放是面对着台湾的，而上海浦东的开发开放是面对世界的。在老人家的心目中，浦东的开发开放，是一盘大棋中重要的一步棋。他甚至讲过，浦东的开发开放晚了5年，如果要早一点起步更好。

食管鳞状细胞癌组织 MMP-1阳性表达率较高，本实验对象118例患者中有89例过表达（75.42%）（图C，D）。其中浸润至深肌层和外膜层90例有79例过表达（80%），而浸润至粘膜层及浅肌层28例中17例过表达（60.7%）；淋巴结转移组52例中44例过表达（84.6%），无淋巴结转移组66例中45例过表达（68%）；临床分期Ⅲ-Ⅳ期组86例中70例过表达（81.4%），Ⅰ-Ⅱ期32例中19例过表达（59.4%）。MMP-1的过表达与患者年龄、性别、分化程度无关，但与肿瘤的浸润深度（深肌层和外膜层VS）、临床分期以及有无淋巴结转移有关（表1，P＜0.05）。

表1 MMP-1蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达情况及其与临床病理参数的关系Table 1 Over-expression of MMP-1protein in ESCC and the relationship with clinicopathological parameters.

3.MMP-1表达与VM的关系

118例食管鳞状细胞癌标本中有34例存在VM，有 VM 组 MMP-1过表达的为30（88.24%）比率高于无VM（70.23%）组，两组之间的差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 食管鳞状细胞癌中MMP-1蛋白的表达与VM的关系Table 2The expression of MMP-1protein in ESCC and the relation with vasculogenic mimicry（VM）

讨 论

血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移过程的必要条件。虽然到目前为止肿瘤血管生成的诱发和调节机制尚不十分清楚，但对血管生成在肿瘤的生长及侵袭转移过程中所具有的重要作用已成共识。有报道，实体性肿瘤直径大于2mm时，其进一步的发展必须依赖于血管生成，这些新生的血管网络系统为肿瘤的生长提供充分的氧养料，保证了肿瘤细胞的快速增殖能力。肿瘤组织内的新生血管，一方面可通过保证肿瘤细胞的氧供、营养及代谢产物的排泄来促进肿瘤的生长；另一方面，由于其管壁结构缺乏完整性，内皮细胞之间连接松散，基底膜厚薄不一、断裂或缺如等原因，瘤细胞易于进入血管腔而发生血行侵袭和转移。血管生成拟态（VM）作为一种新的高度恶性肿瘤血供方式正在被越来越多的人所接受。

VM是1999年被 Maniotis［8］等首次提出，即后来被Folberg等［9］描述的PAS（Periodic Acid-Shiff＇s Reaction，PAS）阳性图案：直的、平行排列的、十字交叉的、彩虹样的（没有完全封闭）、有分支的彩虹样的、封闭的环状的和网络状的通道（即最少有3个背靠背的PAS阳性环）。该通道的特点是无内皮细胞衬覆，内皮细胞特异标记物（CD31，CD34，FⅧ）染色均为阴性，肿瘤细胞模仿机体血管形成而形成瘤细胞条索并围成通道，而血液则在这无内皮细胞的通道中流动，通道外周是一层厚薄不一的PAS阳性物质构成的基底膜。本实验发现在食管鳞状细胞癌中存在VM，且在VM周边的肿瘤细胞很少有坏死发生。说明在VM存在的情况下确实形成了有效的血液供应模式。正如Zhang et al［10］.提出的肿瘤血供的“三阶段现象”，即早期肿瘤的血供主要是VM形成的功能性微循环，之后内皮细胞长入肿瘤细胞之间形成马赛克血管，管腔由肿瘤细胞和内皮细胞共同构成，然后进一步成熟为内皮依赖性血管。

很多研究显示，如果某些肿瘤组织存在VM现象其预后较差。但是，对于该通道形成的分子构建及调节机制知之甚少。通过对恶性黑色素瘤细胞的三维成像研究发现VM的形成和血管内皮钙粘蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin），肝细 胞 肝癌-A2产生的红细胞生成素（erythropoietin-producing hepatocellular carcicnoma-A2，EPHA2），基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和层粘连蛋白 （laminin 5-γ-2-chain，LAMC2）有关［11-13］。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）是降解细胞外基质重要的酶类，MMPs与是一类依赖金属离子锌（Zn2＋）的锌肽酶超家族，其作用底物为细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），MMPs几乎可以降解细胞外基质中的所有成分。间质胶原酶（MMP-1），是第一个被定性的基质金属蛋白酶。MMP-1具有降解明胶、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型胶原和Ⅹ型胶原的作用，从而破坏基底膜，降解细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），有利于肿瘤细胞的浸润与转移。MMP-1和 MMP-2激活后能促进LN-5γ2链裂解为γ2和γ2x，沉积于肿瘤细胞的外环境中，促进肿瘤形成VM。Hedrix［14］等研究的恶性黑色素瘤细胞中LN-5γ2链及 MMPs在VM网状结构存在区域高表达，应用LN-5γ2寡义核苷酸和 MT1-MMP抗体可减弱或抑制VM的形成。本实验发现食管鳞状细胞癌中存在VM组的MMP-1蛋白的过表达率显著高于不存在 VM（P＜0.05）。MMP-1的过表达和患者的年龄，性别及肿瘤的分级无关（P＞0.05），而和肿瘤的浸润深度、临床分期以及有无淋巴结转移有关（P＜0.05）。

迄今为止，MMP-1蛋白促进VM形成的具体机制上部清楚，这将是我们今后研究的重点。希望我的研究可以为临床关于阻断肿瘤的血供的"截流"疗法提供指导意义。

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［13］Seftor RE，Seftor EA，Koshikawa N，et al.Cooperative interactions of laminin 5gamma2chain，matrix metalloproteinase-2，and membrane type-1-matrix／metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggres-sive melanoma.Cancer Res，2001，61：6322-6327

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图 版 说 明

图B 食管鳞状细胞癌中内皮依赖性血管（CD31和PAS套染 ×400）

图C 食管鳞状细胞癌中VM组MMP-1强阳性表达（Elivision×100）

图D 食管鳞状细胞癌中VM组MMP-1强阳性表达（Elivision×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.A There is VM in ESCC.（CD31and PAS double staining×400）

Fig.B Endothelium dependent blood vessel in ESCC.（CD31

and PAS double staining×400）

Fig.C Over-expression of MMP-1in ESCC.（Elivision×100）

Fig.D Over-expression of MMP-1in ESCC.（Elivision×400）

Vasculogenic mimicry in esophageal squamous cell carcinoma and the expression of matrix metalloproteinase-1

Chai Damin1＊，Bao Zhengqi2，Feng Zhenzhong1，Ma li1，Wang Danna1，Tao Yisheng1＊
（1Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College；Department of Pathology，Bengbu Medical College；2The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

Objective To study whether vasculogenic mimicry（VM）exist in human esophageal squamous cell carcinoma（ESCC），its relationship with matrix metalloproteinase-1（MMP-1）and clinicopathological parameters.Methods 118specimens of primary ESCC and their clinical data were collected，and dual staining of CD34and Periodic Acid-Schiff（PAS）were performed to validate the existence of VM in ESCC.MMP-1over-expression was then detected in both groups with and without VM to analyze the relationship between VM and MMP-1protein，and the correlation of MMP-1and clinicopathological parameters of ESCC.Results VM existed in 34（28.81%）of 118cases，and the over-expression of MMP-1in cases with VM was obviously higher than that without VM （P＜0.05）.The over-expression of MMP-1protein in patients with lymph nodes metastasis was higher than that without it（P＜0.05）.The over-expression of MMP-1protein in patients with invasion in deep muscular layer and adventitial layer was higher than that in mucosa and superficial muscular layer（P＜0.05），and higher inⅢ～Ⅳstages than inⅠ～Ⅱstage.Conclusion VM existed in ESCC and the over-expression of MMP-1protein may promote VM formation，lymph node metastasis and invasion.

Esophageal Squamous Cell Carcinoma；Matrix metalloproteinase-1；Vasculogenic Mimicry；Immunohistochemical Staining；Metastasis

R329

A

10.3870／zgzzhx.2012.01.010

2011-10-25

2011-12-06

安徽省高校优秀青年人才基金（2009SQRZ130）；安徽省教育厅自然科学研究重点项目（KJ2011A203）；蚌埠医学院基金（BY0801）

柴大敏，女（1981年），汉族，讲师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）