静电纺丝壳聚糖－明胶复合纤维的制备和体外生物相容性评价

何晨光 赵莉

静电纺丝技术是一种制备纳米纤维的最简单的方法。通过静电纺丝技术，可以获得纤维直径均一，成分多样的超长纤维[1-2]。静电纺丝是一种利用聚合物溶液或熔体在强电场作用下，形成喷射流进行纺丝加工的工艺[3-4]。与其他方法相比，静电纺丝技术制备的纳米纤维支架因具有较大的比表面积，较强的力学性能和较高的孔隙率，而更接近细胞外基质的结构。因此，静电纺丝技术被广泛应用于组织工程的支架材料领域[5-7]。

壳聚糖是甲壳素部分脱乙酰化衍生物，它是由β(1～4)相连的D-葡聚胺与含量不等的N-乙酰葡聚胺无规排列起来的一种线性聚糖的多聚糖[8]。壳聚糖无毒，抗菌，具有良好的生物降解性能，可作为伤口敷料，能有效防止黏连，促进伤口愈合[9]。明胶是通过胶原部分水解而得到的，是胶原的变性产物。明胶的化学成分和胶原类似，作为一种蛋白质，明胶由一组氨基酸单链组成，可用于膨胀剂、伤口敷料、粘结剂和外科用可吸收垫片等[10]。明胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且没有免疫原性；同时，明胶含有丰富的氨基和羧基亲水基团，有助于营养成分和氧气的渗入。壳聚糖和明胶被广泛应用于皮肤组织工程支架材料中[11-13]。用静电纺丝技术制备壳聚糖和明胶复合纤维支架，可以充分发挥壳聚糖抗菌和防黏连的特性，以及明胶吸水和防渗出的特性，模拟皮肤的结构，促进伤口愈合，满足组织工程皮肤支架材料的要求。

我们采用静电纺丝技术制备壳聚糖－明胶复合纤维支架，研究纺丝参数对支架纤维结构的影响，并将人皮肤成纤维细胞接种在支架材料上，观察细胞的形态以及细胞在支架材料上的生长情况，探讨壳聚糖－明胶复合纤维支架作为皮肤组织工程支架材料的可行性。

1 材料及方法

1.1 材料

壳聚糖（CS，Medium molecular weight，Sigma-Aldrich）；明胶（GE，国药集团试剂有限公司）；三氟乙酸（TFA，CP），二氯甲烷（DCM），醋酸，乙二醇和氢氧化钠（NaOH）购自国药集团试剂有限公司，分析级。 戊二醛（Gultaraldehyde，Grade-I，Sigma-Aldrich）。

DMEM（High Glucose，HyClone）；FBS（Fetal Bovine Serum，SAFC Biosciencestm）；CCK-8(Cell Counting Kit-8，DojinDo)。

1.2 纤维支架制备

1.2.1 壳聚糖纤维支架制备

以体积比为5∶1的三氟乙酸与二氯甲烷混合溶液为溶剂，配制浓度为3～5 wt%的壳聚糖溶液，在16～20 KV范围内调节电压，并在0.4～2.0 mL/h范围内调节流速。收集、干燥后获得具有不同表面形貌的壳聚糖纤维支架。

1.2.2 明胶纤维支架的制备

以体积比为9.5∶1的醋酸与乙二醇混合溶液为溶剂，配制不同浓度明胶溶液，在13～20 KV范围内调节电压，并在流速为0.4 mL/h条件下进行纺丝。收集、干燥后获得具有不同表面形貌的明胶纤维支架。

1.2.3 壳聚糖－明胶复合纤维支架制备

以体积比为7∶1的三氟乙酸与二氯甲烷为溶剂，首先加入壳聚糖，搅拌形成均一的壳聚糖溶液；按比例加入明胶，继续搅拌，配制成浓度为6 wt%的壳聚糖/明胶混合溶液。调节电压和纺丝间距，在电场强度为1.8 KV/cm，流速为1.0 mL/h条件下进行静电纺丝。为观察不同配比壳聚糖/明胶复合纤维支架的性能，壳聚糖/明胶的质量比分别设为1∶3、1∶1和3∶1。收集、干燥后获得具有不同表面形貌的壳聚糖-明胶纤维支架。

1.3 纤维支架的交联

将浓度为25%的5 mL戊二醛溶液置于密闭干燥器，放入纤维支架，用戊二醛蒸气交联3 h，再放入100℃真空烘箱内，抽真空干燥1 h，去除残留的戊二醛，干燥结束后将支架放入干燥器。

为使支架在液体环境中更好的保持其纤维结构，交联后的纤维支架用0.5 M/L的NaOH溶液浸泡30min，再以去离子水洗至液体呈中性。

1.4 支架的表征

纤维支架的形貌用扫描电镜来进行观察。分别取支架样品，表面经离子溅射仪喷金镀膜后，用Hitachi S-450扫描电镜观察支架的表面形貌。采用图像分析软件测定扫描电镜照片中支架的纤维直径，每个样品的电镜照片取30根纤维计算平均直径。

Analysis of Influencing Factors on Fatigue of Offshore Wind Turbine Monopile Foundation WANG Hongqing,LIU Xudong,BI Mingjun,LIU Jinchao(92)

1.5 细胞接种

选择壳聚糖/明胶质量比为3∶1的复合纤维支架，将支架材料裁成1.5 cm×1.5 cm大小，75%医用乙醇浸泡1 h，然后用磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，加入细胞培养液（含10%胎牛血清的 DMEM），置于37℃、5%CO2培养箱内浸润过夜，接种细胞前将材料移至6孔板。

原代培养的人真皮成纤维细胞体外传代培养至第5代，待细胞铺满培养皿底部时，用0.25%胰酶消化，按3×105cells/cm2的密度接种于材料表面，待细胞黏附4h后，加入足量的细胞培养液培养，隔天换液。

1.6 细胞在纤维支架材料上的形貌

细胞接种后第3、5、7天，取出细胞-材料复合物，用PBS轻轻冲洗2次，放入2.5%戊二醛溶液中，4℃固定24h，再用六甲基二硅胺烷逐级脱水干燥。采用SEM观察细胞在支架表面的形貌。

1.7 细胞在纤维支架材料上的增殖

用CCK-8试剂定量检测细胞材料复合物上活细胞数量，并绘制生长曲线，观察其增殖情况。将材料剪裁成1.5 cm×1.5 cm的尺寸，75%医用乙醇浸泡后，PBS冲洗3次，然后放入24孔板。每块材料接种1.4×104个细胞，加入适量细胞培养液置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 分别于接种后第 1、3、5、7、9天吸去培养液，每孔加入100μL CCK-8溶液，放入37℃烘箱孵育2 h，取上清液加入96孔板，测定在450 nm处的吸光度值，并绘制标准曲线[14]。

2 结果

2.1 壳聚糖纤维支架的形貌

壳聚糖纤维支架的制备参数及对应的纤维直径如表1。

2.1.1 电压对纤维支架形貌的影响

2.1.2 浓度对纤维形貌的影响

浓度对纤维直径有明显的影响。由表1可知，随着浓度的增加，纤维直径从（0.53±0.26）μm，增加至（0.8±0.29） μm，当浓度为 4.3 wt%时，纤维直径增加至（1.2±0.3）μm。浓度增加，壳聚糖溶液成纤效果差，大多数纤维粘结在一起，纤维间一些直径较小的纤维在干燥过程中发生断裂（图2）。

2.2 明胶纤维支架的形貌

明胶纤维支架的制备参数及纤维直径如表2所示。当保持其他参数不变时，随着纺丝溶液浓度增加，纤维直径随之增加。溶液浓度从19.4 wt%增加到 24.6 wt%时，纤维直径由（0.224±0.06）μm 增加至（0.87±0.18）μm。但纺丝溶液浓度在19.4 wt%和22 wt%之间变化时，纤维直径变化不大，反而随着浓度增加，直径略有降低。

纺丝时，电压增加，明胶纤维的直径略有增大。当电压从13 KV增加至20 KV时，纤维直径从（0.19±0.06） μm 增大至（0.217±0.08） μm（图 3）。

2.3 壳聚糖－明胶复合纤维支架

壳聚糖－明胶复合纤维支架的制备参数及性能参数如表3所示。壳聚糖/明胶质量比增加时，溶液粘度变大；壳聚糖/明胶质量比增加时，纤维粘连增多，纤维支架孔隙变小，更加致密。而且，当壳聚糖含量增加时，虽然溶液浓度保持不变，但纤维直径仍然显著增加（图 4，5）。

2.4 细胞在纤维支架上的形貌

成纤维细胞接种在壳聚糖－明胶复合纤维支架（壳聚糖/明胶质量比为 3∶1）上，培养 3 d后，细胞已基本铺满整个支架表面，透过细胞层间隙，还可见到纤维。细胞呈典型的梭状，细胞基质分泌旺盛。培养5 d后，支架表面难以看到露出的纤维，细胞基质更加丰富，细胞形态更加伸展（图6）。培养7 d后，由于细胞层增厚，扫描电镜观察时，电子束强，样品放电严重，结果无法显示。

2.5 细胞在纤维支架上的增殖

细胞接种在材料上后，前3 d增殖不明显，细胞数量没有快速增加。接种3 d后，细胞在3种比例纤维支架上都开始生长，并在5 d后进入快速增长期。壳聚糖/明胶质量比为1∶1的复合纤维支架组，培养7 d后，细胞生长进入平台期，增殖缓慢。而另外两种比例的纤维支架上，培养到第9天，细胞仍然在不断增殖，尤其是壳聚糖/明胶质量比为3∶1的复合纤维支架，7 d后，细胞在支架上的增殖速度更是超过了质量比为1∶3的复合纤维支架（图7）。

表1 壳聚糖纤维支架制备参数及纤维直径Table 1 Preparation parameters and fiber diameter of chitosan fibers

图1 电压对壳聚糖纤维支架形貌的影响。纺丝溶液浓度为3.7 wt%，流速为0.4 mL/h，纺丝间距为10 cm；A：电压为16 KV；B：电压为20 KVFig.1 Influence of votage on chitosan fibers at the concentration of 3.7 wt%,a feeding rate of 0.4 ml/h,a tip-target distance of 10cm with the different applied voltages of(A)16 KV;(B)20 KV

图2 壳聚糖纤维支架SEM观察，纺丝过程中电压为20 KV，溶液流速为0.4 mL/h。A：浓度为3.7 wt%；B：浓度为4 wt%；C：浓度为4.3 wt%Fig.2 SEM micrograph of the chitosan fibers at the applied voltage of 20 KV,a feeding rate of 0.4 mL/h with different concentrations of(A)3.7 wt%;(b)4 wt%;(c)4.3 wt%

表2 明胶纤维支架制备参数及纤维直径Table 2 Preparation parameters and fiber diameter of gelatin fibers

图3 不同制备参数下的明胶纤维支架的SEM观察。溶液流速为0.4 mL/h，纺丝间距为10 cm。A：浓度为19.4 wt%，电压为13 KV；B：浓度为22 wt%，电压为13 KV；C：浓度为24.6 wt%，电压为13 KV；D：浓度为22 wt%，电压为20 KVFig.3 SEM micrograph of the gelatin fibers at a feeding rate of 0.4 mL/h with the tip-target distance of 10cm with different concentrations and applied voltages of(A)19.4 wt%,13 KV;(B)22 wt%,13 KV;(C)24.6 wt%,13 KV;(D)22 wt%,20 KV

表3 壳聚糖－明胶复合纤维支架的制备参数及性能参数Table 3 Preparation and performance parameters of chitosan/gelatin composite fibers

图4 壳聚糖/明胶质量比对纤维平均直径和溶液粘度的影响Fig.4 Influence of chitosan/gelatin ratios on the average fiber diameter and solution viscosity

图5 不同配比壳聚糖－明胶复合纤维支架的SEM照片Fig.5 SEM micrograph of the electrospun chitosan/gelatin composite fibers in different mass ratios

图6 成纤维细胞接种在壳聚糖-明胶复合纤维支架上，培养3 d（A）和5 d（B）后，细胞在支架上的铺展形态Fig.6 Cell morphology on the chitosan/gelatin composite fibrous scaffolds after the culture of 3 days(A)and 5 days(B)

图7 人成纤维细胞在3种不同壳聚糖/明胶质量比纤维支架上的增殖情况Fig.7 Proliferation curve of human fibroblast cultured in the chitosan/gelatin composite fibrous scaffolds

3 讨论

静电纺丝技术自1934年Formalas发明专利以来，近几十年得到飞速发展。迄今为止，有近百种聚合物通过静电纺丝技术纺制成纤维，陶瓷材料如羟基磷灰石[15]、生物活性玻璃[16]等，复合材料如PCL/CaCO3[17]、HA/PVP[18]、聚乳酸/硅酸钙[19]等，也都在不同的参数下制备出纳米纤维。静电纺丝技术获得的纤维直径从毫米级到纳米级，可满足不同的需要[20]。由于静电纺丝制备的纤维类似细胞外基质，故而在组织工程支架材料方面得到广泛应用。

壳聚糖和明胶是皮肤组织工程支架常用的材料，过去常用的支架制备方法是冷冻干燥法[21-23]。静电纺丝技术的出现，为皮肤组织工程支架的制备提供了一种新的方法[24-31]。本实验采用三氟乙酸和二氯甲烷混合溶剂，制备无珠状结构的壳聚糖-明胶复合纤维支架，着重对3种不同质量比的复合支架进行研究，并利用人成纤维细胞观察复合纤维支架的体外相容性。

我们首先制备了壳聚糖纤维和明胶纤维。在选择溶剂时，醋酸是首选。但是在纺制壳聚糖纤维时，发现醋酸挥发性差，难以获得理想的纤维支架。明胶对溶剂的适应性强，当以醋酸和乙二醇为溶剂时，纺丝溶液浓度可接近25 wt%。对于壳聚糖纤维支架而言，选择三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液为溶剂，制备出的纤维均匀，无珠滴。三氟乙酸挥发性好，溶解能力强，可以和壳聚糖中带正电的氨基基团形成盐，从而破坏壳聚糖分子间的相互作用，因而使得壳聚糖溶液具有很好的流动性[30]。然而，即使以三氟乙酸和二氯甲烷为溶剂，可纺丝的壳聚糖溶液浓度仍然低于5 wt%，溶液黏度不超过2 Pa.s。溶液浓度过高，黏度太大，溶液推进困难，而且增加电压，也难以克服溶液的表面张力，从针头出来的溶液黏结在一起，造成多股纤维粘结。明胶溶液流动性好，黏度低，可在很大浓度范围内进行纺丝。

纺丝溶液浓度是影响纤维质量和纤维直径的主要因素，电压是另一个影响因素。电压偏低时，喷射流不能形成，容易在收集板上出现液滴。我们所施加的电压均是能够形成连续均一的纤维。电压增加，可以形成喷射流，并克服液滴的表面张力，使之形成Taylor锥，最后纤维收集在收集板上。本研究中，电压增加，纤维直径略有增大，但没有显著差异。这是因为电压增加时，纺丝溶液从针头到达收集板的时间缩短，纤维在形成Taylor锥的过程中没有经过充分的牵伸，因此纤维直径略有增大。与纺丝溶液浓度对纤维直径的影响相比，电压对纤维直径的影响较小。

壳聚糖和明胶复合时，在同样的浓度下，复合溶液的黏度随着明胶含量的增加而减小，同时复合纤维直径也相应减小。本研究选择了3种壳聚糖/明胶质量比，均获得无珠滴、纤维均一的复合纤维支架。壳聚糖大分子中，NH2+和OH-基团对形成很强的氢键相互作用具有重要意义。加入明胶后，明胶的螺旋微结构可使壳聚糖链段之间的分子间相互作用降低，从而在功能键间形成氢键。由于这些键比壳聚糖本身的功能键弱，因而壳聚糖/明胶复合溶液的黏度降低，在静电纺丝时更容易形成Taylor锥，从而获得均一、超细且无珠滴的复合纤维[31]。

壳聚糖和明胶都是具有良好生物相容性的天然高分子材料。我们在前期的研究中，将壳聚糖和明胶复合，制备出用于表皮细胞生长的膜片。结果显示，细胞在膜片上增殖良好，可用于修复裸鼠创面和瘢痕的治疗[32-33]。本研究中，来源于小儿包皮的人成纤维细胞经传代后，接种于壳聚糖－明胶复合纤维支架，培养3 d后，细胞已铺满大部分的支架表面，说明静电纺丝壳聚糖－明胶复合纤维支架具有良好的细胞相容性。细胞在支架表面铺展良好，呈典型的梭状，而且随着培养时间的增加，增殖良好；培养5 d后，细胞数量进一步增加，支架表面已全部被细胞铺满；培养7 d后，由于细胞数量增加，细胞层增厚，SEM观察时，样品放电现象严重，没有结果显示。细胞增殖曲线进一步验证了这一点。该结果证明成纤维细胞在壳聚糖－明胶复合纤维支架上生长良好，壳聚糖－明胶复合纤维支架是潜在的皮肤组织工程支架材料。

4 结论

本研究以三氟乙酸和二氯甲烷为溶剂，纺丝电压为18 KV、流速为1 mL/h，纺丝溶液浓度为6 wt%，获得的复合纤维支架具有均一、光滑、无珠滴的纤维形貌。随着纺丝溶液浓度的增加，纤维平均直径随之增加。在其他参数保持不变的条件下，壳聚糖/明胶质量比增加，纺丝溶液黏度增加，平均纤维直径也随之增加。电压对纤维直径没有显著影响。将人成纤维细胞接种在壳聚糖－明胶复合纤维支架上，细胞生长良好，增殖快。本研究制备的壳聚糖－明胶复合纤维支架具有良好的生物相容性，有望作为皮肤组织工程支架材料。

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