转染ANGPTL-1基因对人皮肤成纤维细胞胶原表达的影响

宋仁刚

血管生成素相关蛋白(ANGPTL-1)是新发现的一种与血管生成、脂类代谢、糖代谢和胰岛素敏感性密切相关的分泌型糖蛋白，该家族已发现ANGPTL-1～7。ANGPTL-1与血管生成素的结构相似，属于纤维蛋白原家族。然而，ANGPTL-1不能与Tie－2受体结合，因此不是真正意义上的血管生成素，故命名为血管生成素样蛋白(ANGPTL-1)[1-3]。我们的前期研究表明，ANGPTL－1基因在青年小鼠尾部皮肤中的表达明显高于老年小鼠[4-5]。为进一步研究ANGPTL－1基因在皮肤细胞中的作用，本实验以人皮肤成纤维细胞转染ANGPTL－1基因，探讨ANGPTL－1转染人皮肤成纤维细胞的可行性，及转染后对细胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌top10，高效真核表达载体pcDNA3.0(Invitrogen公司，美国)，DMEM培养基、胰蛋白酶（Gibco 公司，美国），胎牛血清（FBS，Hyclone 公司,美国），胶原酶NB4（Serva公司，德国）,脂质体Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美国），PCR 引物由上海生物工程公司合成，TRIzol RNA抽提试剂盒（Gibco公司，美国），RT-PCR 试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa 公司，日本），GeneRulerTM1 kb DNA Ladder（Fermentas公司，立陶宛）。 激光共聚焦显微镜（Leica 公司，德国），ABI 7300 Real-time PCR扩增仪（ABI公司，美国），GIS22800型凝胶图像处理系统（上海天能科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 ANGPTL－1真核表达载体构建与鉴定

目的基因ANGPTL－1 cDNA片段由RT-PCR方法获取。PCR扩增引物Full length-F:5'－AGCAGGCAGTCAGAGTGGG－3'，Full length-R:5'－TGGAAGGAAGAGCCGAGAC－3'；PCR 条件为：模板 2μL，PCR 缓冲液 5μL，上游引物 1μL，下游引物1μL，TaqDNA 聚合酶 1μL，dNT4μL，H2O 36μL。94 ℃ 4min，然后 94 ℃ 30 sec、68 ℃ 2.5min（35个循环），再68℃延伸10min，产物长度3123 bp。PCR纯化产物装入克隆载体PMD 18-T，大肠杆菌top10在LB固体培养皿上涂片培养,经蓝白斑筛选，挑取单个白色菌落在含氨苄青霉素的LB培养液中扩增。用HindⅢ和XbaI双酶切TA载体回收目的片段，表达载体pcDNA3.0用HindⅢ和XbaI双酶切回收线性载体，两者用T4连接酶连接，构建pcDNA-ANGPTL-1，经酶切电泳鉴定。

1.2.2 细胞培养与分组

皮肤标本来源于深圳市人民医院门诊患者，无菌条件下切取标本，以0.5%氯霉素冲洗标本并浸泡10min，将标本剪碎至1～2 mm3大小，0.3%NB4复合胶原酶，37℃摇床消化3 h，150目滤网收集过滤液，1500 r/min离心 10min，收集细胞，按 2×104个/cm2接种于培养皿，24h后首次换液。准备传代，转染。分组：未转染正常组、转染空载体pcDNA3.0组和pcDNA3.0-ANGPTL-1转染组。

1.2.3 细胞转染

细胞转染前24h，按2×105个/孔接种于6孔板，细胞生长至30%～45%融合时转染质粒。方法：取无血清 DMEM 培养液 240μL与 10μL Lipofectamine 2000混匀，另取 240μL DMEM 培养液与 10μL（100 pmol）质粒混匀，5min后分别合并脂质体和质粒两液，室温放置20min。吸掉培养液，以1.5 mL/孔加纯DMEM培养基，再加入脂质体质粒液，37℃培养5 h后，弃转染液，换10%FBS的DMEM培养液培养。

1.2.4 Real－time PCR 检测

分别收集对数生长期的未转染正常组细胞、转染空载体pcDNA3.0和ANGPTL-1转染组的细胞，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量后，行逆转录反应（RT）。取总 RNA 1 μg，oligo dT 1μL（0.5 μg）， 补足 DEPC 处理的 ddH2O 至 13μL，65℃变性5min，立即置冰浴，加RNase抑制剂20 U，2.5 mmol/L dNTP 1μL，5×逆转录酶缓冲液 4μL，M-MLV 逆转录酶 200 U 2μL，总体积 20μL。 反应程序：25 ℃ 15min，37 ℃反应 1 h，95 ℃ 5min。终止反应后，RT产物行Real-time PCR法检测NOS、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达。根据人ANGPTL-1基因及Ⅰ、Ⅲ型胶原基因序列，设计上、下游引物序列。ANGPTL-1-F：5'-TTCTACAGAGGCTCGTGGCT-3'，ANGPTL-1-R：5'-GTATCATGAGTACCCGGTGT-3'；Col-Ⅰ-F：5'-GAACGCGTGTCATCCCTTGT-3'，Col-Ⅰ -R：5'-GAACGAGGTAGTCTTTCAGCAACA-3'；Col-Ⅲ-F：5'-AACACGCAAGGCTGTGAGACT-3'，Col- Ⅲ -R：5'-GCCAACGTCCACACCAAATT-3'。RT产物稀释10倍后取1μL作为模板 ，加入2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5μL，上游引物、下游引物（10 pmol）各1μL， ddH2O 补足体积到 25μL。反应条件：50℃ 2min，95℃变性 15min后，95℃15 sec，60 ℃ 1min，40 个循环。

1.2.5 流式细胞仪检测

当被转染细胞生长至70%融合时，收集、离心，调整细胞浓度为1×106cells/mL，上样，行流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 ANGPTL－1基因克隆及表达载体构建

利用RT-PCR成功扩增了ANGPTL-1基因全长，约3.3 Kb。载体在2%琼脂糖凝胶中可见约8.4 Kb DNA带，与预期质粒大小结果相一致，用HindⅢ和XbaI双酶切电泳，在同一泳道中出现2条DNA带，1条5.5 Kb，与空质粒DNA链长度一致，确定为质粒 DNA带；另 1条 3.1 Kb，与 ANGPTL-1 cDNA片段大小一致。基因测序后，证实所合成基因序列与基因库中一致率为99.95%。

2.2 人皮肤成纤维细胞ANGPTL－1转染率

流式细胞仪检测提示，人皮肤成纤维细胞被转染48 h后，（63±7.1）%的被转染细胞表达报告基因荧光（图 1）。

图1 人皮肤成纤维细胞成功转染ANGPTL-1，细胞内可见绿色荧光表达Fig.1 Observation of GFP reporter gene vector.Green fluorecence can be seen in the hypertrophic scar fibroblasts after target cells were transfected

2.3 RT-PCR检测 ANGPTL－1 mRNA表达

转染24h后，Real-time PCR检测到ANGPTL-1 mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为（5.24±1.16）、（1.71±0.32）和（1.89±0.19），转染组的相对表达量较未转染组和转染空载体组明显增高（P<0.01，n＝5）；未转染组和转染空载体组比较无统计学差异（P>0.05，n＝5）（图 2）。

图2 ANGPTL-1 mRNA的表达Fig.2 The relative expression of ANGPTL-1 mRNA

2.4 ANGPTL－1转染后对细胞 Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRNA在转染组、转染空载体组、未转染组细胞中的表达分别为（3.33±0.53）与（2.09±0.26）、（0.91±0.19）与（0.93±0.26）和（0.94±0.14）与（0.95±0.22）。转染组的相对表达量较未转染组和转染空载体组均明显增高（P<0.01，n＝5）（图 3）。

图3 Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达Fig.3 Expression of collagenⅠ,Ⅲ mRNA

3 讨论

关于ANGPTL-1基因作用的研究，目前主要集中在血管发生、内皮细胞的保护及胚胎器官发生等方面，其他方面较少涉及。根据基因芯片数据分析，ANGPTL-1基因在青年小鼠与老年小鼠尾部皮肤中表达差异显著[4-5]。此外，我们的前期研究中还发现，ANGPTL-1基因的表达与Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达呈相关性。因此，我们设计了先构建ANGPTL-1基因再进行细胞转染的研究方案，并采用真核表达载体，保证了研究结果的可靠性。

重组的ANGPTL-1基因转入体外培养的人皮肤成纤维细胞后，转染的ANGPTL-1转录因子能否有效表达，是判断转染成功与否的关键。我们采用流式细胞仪观察与相对精确的Real-time PCR方法相结合[6-7]，发现（63±7.1）%的细胞表达报告基因，而且转染组表达明显高于对照组。提示ANGPTL-1基因已成功转入人皮肤成纤维细胞内。

胶原蛋白是人体真皮组织中的重要组成部分，随着紫外线的不断照射以及人年龄的增加，皮肤内透明质酸与胶原蛋白的含量逐渐减低，真皮组织被氧化、皮肤塌陷、萎缩。皮肤表现为粗糙、干燥、皱纹增大、松弛等一系列衰老征象[2]。本实验结果表明，转染后，细胞内Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA合成增加。ANGPTL-1表达增强可导致皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达加强。进而提示我们，控制ANGPTL-1的过度表达有可能控制皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达，进而调节皮肤的老化。

综上所述，我们证实皮肤成纤维细胞可作为ANGPTL-1转染的靶细胞；通过调节ANGPTL-1基因，可调节皮肤中胶原含量，起到延缓衰老的作用。

[1]Lai DM,Tu YK,Hsieh YH,et al.Angiopoietin like protein 1 expression is related to intermuscular connective tissue and cartilage development[J].Dev Dyn,2007,236(9):2643-2652.

[2]Wei D,Zhang L,Williams DL,et al.Glucan stimulates human dermal fibroblast collagen biosynthesis through a nuclear factor-1 dependent mechanism[J].Wound Repair Regen,2002,10(3):161-168.

[3]Uchihashi T,Kimata M,Tachikawa K,et al.Involvement of nuclear factor I transcription/replication factor in the early stage of chondrocytic differentiation[J].Bone,2007,41(6):1025-1035.

[4]Wu J,Ma B,Yi S,et al.Gene expression of early hypertrophic scar tissue screened by means of cDNA microarrays[J].J Trauma,2004,57(6):1276-1286.

[5]Christner PJ,Hitraya EG,Peters J,et al.Transcriptional activation of the alpha1(I)procollagen gene and up-regulation of alpha1(I)and alpha1(III)procollagen messenger RNA in dermal fibroblasts from tight skin 2 mice[J].Arthritis Rheum,1998,41(12):2132-2142.

[6]Lockey C,Otto E,Long Z.Real-time fluorescence detection of a single DNA molecule[J].Biotechniques,1998,24(5):744-746.

[7]Wang T,Brown MJ.mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction:validation and comparison with RNase protection[J].Anal Biochem,1999,269(1):198-201.