颅缝早闭畸形的遗传学研究进展

杨娴娴 综述 穆雄铮 审校

颅缝早闭症是常见的先天性颅颌面畸形，其发病率居常见颅面发育畸形发病率的第二位（约为1/2500，仅次于唇腭裂畸形）。由于颅缝提早发生骨性闭合可导致颅腔狭小，形成三角头、舟状头、斜头等复杂的颅颌面畸形综合征，不仅造成颅面骨畸形，而且可导致颅内压升高、视力减退甚至失明，严重者可使脑发育受阻，影响患儿的智力发育[1]，或因危险的并发症而危及生命。目前尚无理想的治疗方法能够完全予以修复，对患者及其家庭的社会生活和心理健康产生了诸多负面影响。所以，对该疾病遗传机制的研究具有重要意义。本文就先天性颅缝早闭畸形的遗传学研究现状及进展进行综述。

1 颅骨发育、颅缝闭合的理论

颅骨由脑颅（颅顶）和面颅（颅底）两部分构成，颅骨发育约开始于胚胎第23天，颅顶骨与颅底骨的发育表现为两种不同的方式。颅底骨起源于外胚层神经嵴，由间充质主要以软骨内成骨的方式发育形成，与长骨类似。颅顶骨起源于中胚层，由脑组织周围的间充质以膜内成骨的方式发育而成。在胎儿期和婴儿期，颅顶骨骨化尚未完成，各扁平骨之间存在致密结缔组织构成的膜性连接，包括囟门以及颅缝。后囟出生后不久即封闭，前囟在出生后1.5～2年间消失，颅缝的闭合时间则较迟。

国际上关于颅骨发育、颅缝闭合的理论认为[2]，来自发育大脑的信号是颅骨形成的关键因素，硬脑膜分泌的可溶性生长因子介导的信号转导系统在传送从大脑到脑颅的信号方面起非常重要的作用，大脑、硬脑膜和发育的颅骨、颅缝之间复杂的相互作用，最终引起颅缝的闭合。一旦颅缝周围的生化环境变化及基因遗传的改变干扰了此复杂的生长发育体系，便可导致颅缝的异常闭合。

颅顶骨的发育由多能间充质干细胞向成骨细胞的增殖、分化而形成，具体为间充质干细胞—骨祖细胞—前成骨细胞—成骨细胞的分化过程，历经成骨细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段，最终形成新骨。颅盖的形成最初来源于部分间充质的浓集，称初级骨化中心。随着颅缝两侧颅骨间充质细胞增殖、向成骨细胞分化，颅骨成骨前缘不断向颅缝侧靠拢，颅缝逐渐闭合[3]。纤维颅缝组织如同颅骨间灵活的关节连接，调节头颅的发育和外形结构，正常的颅缝闭合过程依赖颅骨成骨前缘以及颅缝区细胞的增殖与分化维持良好的平衡，此外，细胞的正常凋亡过程也发挥重要的调节作用[4]。上述任何一个过程发生改变，均可导致颅缝早闭或颅裂，其中以颅缝提早闭合较为多见。

2 颅缝早闭的遗传学研究

遗传学研究证实多种基因突变、致畸物质、机械压力或血液、代谢紊乱等将导致颅缝早闭[5-6]。截至2008年，与颅缝早闭相关的突变基因已明确有11个，常见的包括：成纤维细胞生长因子受体（FGFR1，FGFR2，FGFR3）、转化生长因子 β受体（TGFBR1，TGFBR2）、酪氨酸激酶 Eph/Ephrin 家族蛋白（EFNB1）、胚胎发育基因 TWIST1、同源盒基因 MSX2、小 GTP酶蛋白家族 RAB（RAB23）、原纤维蛋白基因（FBN1）、细胞色素P450还原酶基因（POR）等[7-10]。对上述基因及相关信号通道介导的颅缝细胞增殖与分化的研究，阐明了颅缝发育分子调控机制的重要性与复杂性。

2.1 颅骨发育、颅缝闭合的研究模型

目前国际上关于颅缝早闭分子发病机理研究的实验模型，主要包括：①正常动物颅缝组织或细胞；②基因修饰动物模型颅缝组织或细胞；③少数取材于患者的颅缝组织或细胞。其中以前两者为主[11-14]，研究结果主要反映了非灵长类动物颅缝组织的体内发育情况，以及体外环境下应用各种培养基以促进细胞增殖、人为诱导成骨细胞分化的一系列表型特征，而无法实际反映人体内颅缝闭合的过程与分子调控机制。

针对这一弊端，一些学者采用了以人为对象的颅缝早闭研究模型，如取材于同一患者受累颅缝区及正常颅缝区标本，进行基因表达的比较（称体内-体内比较），以筛选发现新的致病基因。由于体内受多因素制约且与外界环境相互影响，所得的结果往往是最终呈现的表现，而非研究者最为关心的颅缝闭合中间过程。因此，最常用于人颅缝早闭研究的方法为：取材自同一患者受累颅缝区及正常颅缝区体外培养细胞之间的比较（称体外-体外比较），该方法不仅可用于基因差别表达的分析，还可用于颅缝复合组织不同细胞群间增殖、分化潜能的功能研究[15-16]。由于伦理道德问题及复杂实验技术的挑战，从患者或正常人群中获取颅缝组织、细胞用于大规模的实验研究相当困难，上述两种研究方法主要应用于实验动物如鼠颅缝早闭的研究[13，17-18]。

目前的体外培养系统，多为人工二维单层培养技术，与体内组织细胞三维的生长环境不同。越来越多的研究发现，组织细胞在体外环境下生长，逐渐丧失了原有的性状，所取得的研究结果与体内的情况不相符，包括导致的基因表达的显著差异[19]。因此，目前开展的颅缝细胞研究，多采用原代或早期传代培养的细胞，以减少体外培养对细胞真实性状的影响，但由于原代细胞生存期短，传代数局限致所产生的细胞量不足等原因，致病基因表达及调控机制的研究仍具有明显的限制性。少数学者尝试应用转化细胞系以延长细胞的生存期，发现它们可能引起细胞不典型表征，从而影响实验结果。

因此，现有颅缝细胞研究模型存在的问题主要为：①如何跨越体外培养颅缝细胞和动物实验间的鸿沟，更好地模拟活体组织的内环境，最大程度地维持颅骨发育的体内性状，保持细胞的功能活性，以全面研究颅缝闭合的过程。②如何将体内、体外两大研究系统更好地结合，对二者基因表达的差异进行同期比较研究，以更准确地评价相关基因在颅缝闭合过程中的作用。③如何克服原代细胞生存期短，体外培养传代细胞性状逐渐发生改变而影响实验结果等问题，有赖于开发既能延长颅缝细胞的生存期，又能最低程度影响细胞表征的实验技术。

近年来的研究趋势是，制造相关致病基因修饰小鼠模型，进行颅缝早闭遗传分子机制及基因或细胞治疗的研究。目前较成熟的为成纤维细胞生长因子及其受体（FGF/FGFR）信号转导通路的研究。FGFR突变可导致Apert、Pfeiffer和Crouzon等颅缝早闭综合征，基因修饰小鼠模型有：FgfR2+/S252W、FgfR2-Ⅲc+/Δ 基因修饰小鼠模型 （Apert综合征）[20-22]；FGFR2+/C342Y基因修饰小鼠模型 （Crouzon综合征）[23]；FGFR1+/P250Arg基因修饰小鼠模型（Pfeiffer综合征）[24-25]。TGF-β 动物模型包括 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TgfbrⅠ、TgfbrⅡ、TgfbrⅢ，和相关细胞间信号转导通路基因如Smad2、Erk1/2等基因敲除小鼠模型。此外，先天性双侧冠状缝早闭兔模型亦常用于颅缝早闭TFG-β信号通路的研究[26-28]。

2.2 颅缝早闭研究的最新进展

随着颅缝早闭发病机理的深入研究，新的致病基因不断被发现，它们之间的相互作用形成了一个非常复杂的颅缝闭合分子调控网络体系。截至目前，已有研究较为明确地阐明了BMPs蛋白介导的TGF-β信号转导系统在啮齿动物颅缝形成过程中的作用机制[29-32]，尚需进一步研究全面揭示上述基因的信号通路作用过程。

研究发现，同一基因突变可致不同的畸形表现型，提示同一基因在不同颅缝间具有特殊的分子信号通路。以额缝的表现最为明显，人类额缝在出生后不久即闭合，而其他颅缝在1岁以后逐渐融合形成锯齿状，相互扣锁，12岁或以后颅缝才紧闭。与啮齿动物的情况相近，啮齿动物的额缝由神经嵴来源的间充质形成并分隔额骨，属于神经嵴起源，而其它颅缝与神经嵴并列或来源于轴旁中胚层[33-35]。许多研究比较了鼠闭合过程中的后额缝与未闭合的冠状缝、矢状缝间基因表达谱的差异，以了解颅缝闭合的基因调控机制[36-41]。然而，鉴于不同发育来源的颅缝闭合信号通路各异，上述比较的结果无法阐明颅缝闭合的分子机制。因此，Coussens等[42]研究同一发育来源的闭合颅缝与未闭颅缝间的基因表达差异。研究发现，与已闭合或正在闭合期颅缝的基因表达相比，未闭颅缝的 RBP4、GPC3、C1QTNF3、IL11RA、PTN、POSTN 等基因表达水平较高，提示上述基因在保持颅缝开放或调控成骨细胞早期分化中起关键作用；已闭合或正在闭合期的颅缝WIF1、ANXA3、CYFIP2等基因表达水平较高，提示它们与颅缝早闭发病的相关性。此外，他们的研究还发现，综合征性与非综合征性颅缝早闭的基因表达谱差异甚微，而不同的未闭合颅缝间基因表达却有显著的差异，尤以额缝最为特殊。尽管普遍认为颅盖发育并未产生软骨前体，在Coussens的研究中发现，人字缝和后矢状缝的形态发生过程中可检测出软骨特殊基因表达与组织学改变，提示颅缝发育可能存在软骨生长过程。上述研究深入至不同颅缝水平分析致病基因的差异表达，为颅缝早闭分子机制的探索开辟了一种新的途径，通过阐明不同颅缝间各异的发育机制，为颅缝疾病的非手术治疗奠定了更充实的理论依据。

为克服体内、体外研究系统下检测的基因表达结果与实际颅缝闭合的基因表达间的差异，Coussens等[19]对颅缝闭合研究模型进行了改良，将体内、体外两大研究系统相结合，对颅缝早闭取材标本及同一组织来源的体外培养颅缝细胞二者间基因表达的差异进行同期比较研究，结果发现，同一基因通过体内-体外研究模型检测的差异程度较体内-体内模型所表现的差异程度更为突出，这为基因表达的灵敏检测提供了便捷，并更能准确地评价相关基因在颅缝闭合过程中的作用。此外，通过对完全分化的受累颅缝组织及体外培养非分化成骨细胞群基因表达的比较，可筛选出成骨细胞分化、矿化相关的基因；与培养细胞相比，在颅缝组织中表达下调的基因则与颅骨发育、颅缝闭合早期细胞的分化抑制或诱导成骨前体细胞的增殖关系密切。

表1 颅骨发育、颅缝闭合相关研究基因Table 1 Genes related to skull growth and cranial suture fusion

表1 续

表1列出了近年来颅骨发育、颅缝闭合相关的主要基因，包括成骨分化相关基因、转录相关基因、信号转导相关基因、骨塑形相关基因、细胞凋亡相关基因、细胞周期相关基因等[42]。通过对上述基因功能及传导通路系统、深入地研究，有望进一步探索颅缝闭合的分子生物学机制。

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