BP1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

贺广珍，李金运，张敬川

(1.徐州市第一人民医院肿瘤内科，江苏 徐州221002;2.徐州医学院附属医院肿瘤内科，江苏 徐州221002)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全球范围内病死率仅次于肺癌，居于第2 位，发病率呈逐年上升的趋势［1］。尽管已发现若干相关分子标志物，但现有证据还不足以充分解释乳腺癌的发病原因。因此，寻找新的治疗靶点，从分子水平探索乳腺癌的发生、发展机制，具有十分重要的意义。

BP1 基因是在研究β 珠蛋白表达调控时被发现并命名的，序列分析表明BP1 是同源盒基因，属于DLX家族。有研究［2］显示在白血病中BP1 基因高表达且具有癌基因特性，其高表达增加K562 细胞在体外致白血病的能力。BP1 是DLX 家族中第1 个与乳腺癌密切相关的基因，在乳腺癌分子水平研究中发现BP1直接结合Bcl-2 启动子并上调Bcl-2 的表达，Bcl-2 是一种抗凋亡基因。为进一步探讨BP1 在乳腺癌发生、发展中的作用及初步探讨其可能的机制，本研究采用Western blot 及免疫组织化学方法检测45 例乳腺癌组织、相应癌旁组织中BP1 的表达和乳腺癌组织中Bcl-2的表达，探讨BP1 与乳腺癌临床病理因素及其与Bcl-2表达的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 45 例乳腺癌组织取自徐州医学院附属医院普外科2008年3月至9月手术切除组织。所有患者术前均未经放、化疗，均为女性，年龄29 ～85岁，中位年龄47.5 岁。取材于手术标本离体20 min内进行，癌组织为肿瘤中心处非坏死组织;相应癌旁组织为距癌灶边缘至少5 cm 的正常乳腺组织。所有癌组织及相应癌旁组织术后均经病理证实。取材后标本迅速置于液氮中冻存，然后转至-80 ℃冰箱保存。再切取1 cm×1 cm×1 cm 大小的标本分别放入2 个装有多聚甲醛液体的广口瓶中固定。组织学类型依据WHO(2003)对乳腺肿瘤病理学的分类标准;TNM 分期依据AJCC(2010)第7 版《乳腺癌TNM 分类及分期》的标准。雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、CerbB-2 及Ki-67 为医院病理科乳腺癌常规检测指标。

1.2 主要试剂 兔抗BP1 多克隆抗体为Novus Biologicals 公司产品。小鼠抗Bcl-2 单克隆抗体、鼠抗βactin 单克隆抗体、碱性磷酸酶标志的马抗小鼠抗体、碱性磷酸酶标志的羊抗兔抗体均为Santa Cruz 公司产品。硝酸纤维过滤膜为Sigma Biotechnology 公司产品。NBT/BCIP 显影剂为Promega 公司产品。即用型SABC 免疫组织化学试剂盒及DAB 显色试剂盒，均购自北京中杉金桥公司。其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.3 实验方法

1.3.1 Western Blot 测定癌组织中BP1、Bcl-2 和癌旁组织中BP1 表达 将-80 ℃冰箱中冻存的癌组织和相应癌旁组织取出，各称取100 mg 组织放入EP 管中，剪刀剪碎，加入1 mL 匀浆液后立即用匀浆器在冰水浴中高速匀浆至无肉眼可见的组织块，然后12 000 r ·min-1、4 ℃离心15 min。小心移取上清液。按改良的Lowary 法，以牛血清白蛋白为标准蛋白，测定蛋白浓度，测定蛋白后分装，置于-80 ℃冰箱冻存备用。将提取的蛋白质与等体积的上样缓冲液混匀，煮沸3～5 min 进行蛋白质变性。按Jiang 等［3］方法等量蛋白样品(每个泳道10-9g)经质量分数10%SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PADE)分离后，以半干转法电转移至硝酸纤维素膜上。转移后的硝酸纤维素膜经质量分数5% 脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗BP1 多克隆抗体(一抗)，1∶1 000;鼠抗Bcl-2 单克隆抗体(一抗)，1 ∶2 000;鼠抗β-actin 单 克隆抗体(一抗)，1∶1 000。4 ℃过夜。次日用缓冲液洗膜3 次，加入相应的二抗(碱性磷酸酶标志的羊抗兔抗体，碱性磷酸酶标志的马抗小鼠抗体1∶1 000)，37 ℃反应2 h。洗膜3 次，以新鲜配制NBT/BCIP 显色，自来水冲洗终止反应。结果以图像处理仪(Gene 公司)扫描，Image J软件进行半定量分析。BP1 蛋白的表达量是以BP1相应条带的A 值除以β-actin相应条带的A 值得到的结果;Bcl-2 蛋白的表达量是以Bcl-2 相应条带的A 值除以β-actin 相应条带的A 值得到的结果。

1.3.2 免疫组织化学染色测定癌组织中BP1、Bcl-2和癌旁组织中BP1 表达 石蜡包埋乳腺组织标本，以片厚6 μm 连续切片，切片脱蜡至水，体积分数3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，微波修复，即用型SABC免疫组化试剂盒A 液封闭，37 ℃1 h;滴加一抗:BP1(1∶300);Bcl-2(1∶500)。4 ℃过夜;滴加B 液，37 ℃1 h;滴加C 液，37 ℃0.5 h。以上各步骤之间均用0.01 mol ·L-1缓冲液冲洗3 次，每次5 min。经DAB 显色后苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。BP1 主要在上皮细胞的胞质和部分胞核中表达，Bcl-2 在乳腺上皮细胞的胞质中表达，相应部位呈现棕黄色颗粒为阳性反应［4］。细胞计数:在显微镜下按统一放大倍数(×40 )进行分析，3 名操作者独立将每张切片按等距抽样原则随机摄取5 个视野。图像采集后用Image-Pro Plus 6.0 辅助图像分析系统计数5个视野的阳性细胞数，取其平均数。

1.4 统计学处理 使用SPSS 13.0 进行统计学分析，连续变量以±s 表示，连续变量组间比较采用t 检验;两变量间的关系采用Pearson 相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 BP1 及Bcl-2 蛋白的表达情况 Western blot 方法测定结果:癌组织中BP1 蛋白表达水平为0.949 ±0.593，相应癌旁组织中为0.095 ±0.057(图1)，癌组织中Bcl-2 蛋白表达水平为0.644 ±0.388(图2)。免疫组织化学染色方法测量结果:癌组织中BP1 阳性细胞数为303.30 ±154.21，癌旁组织中BP1 阳性细胞数为104.08 ±57.97(图3)，癌组织中Bcl-2 阳性细胞数为214.26 ±129.16 (图4)。经配对t 检验分析(表1)，BP1 在癌组织的表达明显高于相应癌旁组织，差异均有统计学意义(P 均＜0.01)。采用Pearson 相关分析，乳腺癌组织中Bcl-2 蛋白表达水平与BP1 蛋白表达水平，两者呈正相关关系(r =0.678，P ＜0.05)(表2);乳腺癌组织中Bcl-2 阳性细胞数与BP1 阳性细胞数表达水平，两者表达呈正相关关系(r =0.653，P ＜0.05)。

2.2 BP1 的表达与乳腺癌临床病理因素的关系BP1 高表达与ER、PR 及C-erbB-2 有关(P ＜0.05)，而与患者年龄、绝经状况、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、Ki-67 无关(P ＞0.05)(表3)。

3 讨论

BP1 是在研究β 珠蛋白表达调控时发现的，已克隆的BP1 cDNA 全长为1 251 bp，开放读码框长约720 bp，编码240 个氨基酸，具有螺旋状的同源异型结构域［5］。BP1 属于DLX 亚家族，又被称为DLX9，与DLX4 和DLX7 互为异构重整体［6］。

图4 免疫组织化学法检测BP1 与Bcl-2在乳腺癌组织中的表达(A:Bcl-2 蛋白，B:BP1 蛋白，×400)

表1 BP1 在乳腺癌组织与相应癌旁组织中的表达

表2 乳腺癌组织中BP1 与Bcl-2 表达的相关性

Man 等［7］发现BP1 蛋白在81%浸润性乳腺癌中表达，而在原位癌、增生性病变及正常组织中表达分别为46%、21%和0%，表明BPl 蛋白可能是肿瘤形成过程中一个重要的上调因子。Man 等［8］研究发现炎性乳腺癌组织中BP1 阳性细胞的百分比和免疫染色强度均明显高于非炎性乳腺癌组织，BP1 蛋白有促进肿瘤进展、侵袭和转移的可能性。本文结果显示:癌组织BP1 蛋白表达水平为0.949 ±0.593，相应癌旁组织为0.095 ±0.057;癌组织BP1 阳性细胞数为303.30 ±154.21，癌旁组织阳性细胞数为104.08 ±57.97。经配对t 检验分析，BP1 在癌组织中的表达明显高于相应癌旁组织。提示BP1 蛋白可能促进乳腺癌的发生、发展。

表3 BP1 蛋白表达与乳腺癌临床病理因素的关系

ER、PR 及C-erbB-2 是判断乳腺癌内分泌敏感性的重要的临床病理指标，对指导临床治疗和判断预后有重要意义。本研究发现:1)BP1 与患者年龄、绝经状况、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、Ki-67均无关;2)BP1 与ER、PR 及C-erbB-2 有关(P ＜0.05)，随着ER、PR 阳性率的增加，BP1 表达水平降低。Fu 等［9］利用RT-PCR 方法证实BP1 的表达率在ER 阳性组显著低于阴性组。本文结果与之一致。Stevenson 等［10］的研究结果显示当应用TNF-α 针对性治疗MCF7 细胞(ER 阳性的乳腺癌细胞株)时，BP1 高表达的MCF7 细胞存活率增加约2 倍。Fu 等［11］发现在ER 阴性的乳腺癌Hs578T 细胞株中，BP1 高表达显著增强细胞的增殖和转移的潜能;随C-erbB-2 阳性率的增加，BP1 表达水平升高，分析可能的原因为:1)BP1 基因图谱与C-erbB-2 临近，定位于17q21 ～22［6］;2)BP1 蛋白与C-erbB-2 蛋白都共定位在乳腺癌细胞的亚型中，且共定位的细胞数随原位癌至浸润癌的进展而增加［10］;3)BP1 基因扩增与HER2/NEU 基因扩增有显著的相关性［12］。ER、PR 低表达与C-erbB-2 高表达的肿瘤通常与更高的治疗抵抗和更差的预后有关。因此，BP1 高表达可能与临床难治肿瘤的预后和治疗有关，检测BP1 在乳腺癌组织中的表达可以更好地指导临床治疗和判断预后。由于BP1 的高表达，在所有ER 阴性的乳腺癌中，BP1 可能成为一个新的治疗靶点。

抑制细胞凋亡是肿瘤形成与发展的一个关键步骤，肿瘤细胞逃避凋亡归因于抑癌基因的失活以及癌基因的激活。Vaux 等［13］首先报道了Bcl-2 有延长细胞生存时间、抑制细胞凋亡的作用。非整倍体肿瘤较整倍体肿瘤更过度表达Bcl-2，说明Bcl-2 可通过抑制凋亡而加强基因不稳定性［14］，过度表达的Bcl-2 在不影响细胞增殖的情况下阻止细胞凋亡。Oh 等［15］研究发现Bcl-2 通过抗细胞凋亡和自噬抑制作用2 个途径抑制肿瘤的发生。Bcl-2 参与了多种肿瘤的发生、发展，其中包括乳腺癌。Stevenson 等［10］研究发现在MCF-7 乳腺癌细胞中，BP1 通过直接结合Bcl-2 P1 启动子区域上游，转录激活Bcl-2 基因，导致Bcl-2 蛋白增加。本文结果:乳腺癌组织中BP1 蛋白表达水平为0.949 ±0.593，Bcl-2 蛋白表达水平为0.644 ±0.388(r=0.678，P=0.00);免疫组织化学检测显示癌组织中BP1 阳性细胞数为303.30 ±154.21，Bcl-2 阳性细胞数为214.26 ±129.16(r =0.653，P =0.001)。BP1与Bcl-2 在癌组织中的表达存在正相关关系，BP1 可能亦转录激活Bcl-2 基因，增加Bcl-2 蛋白的表达。王洋等［16］的研究结果显示，在乳腺癌组织中，BP1 mRNA阳性组凋亡细胞数少于BP1 mRNA 阴性组。由此可见，BP1 可能通过上调Bcl-2 抑制乳腺癌细胞凋亡，这可能是其发挥致癌作用机制之一。

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