树突状细胞的肿瘤个体化治疗

河北医科大学第四医院生物治疗科 汪治宇 王聪敏 李 幸

肿瘤免疫治疗这一概念是基于机体的免疫系统在对抗肿瘤时的调节与反应。有效的免疫治疗的最主要的优点在于相对较少的副作用，针对肿瘤细胞的靶向特异性，并且能产生对抗肿瘤特异性抗原的长期记忆[1]。

树突状细胞在肿瘤特异性免疫反应的诱导和调节中起到重要的作用，这些细胞具有独特的激活抗肿瘤T、B淋巴细胞的功能，并且还能激活自然杀伤细胞[1]。在过去的十年间这一功能被广泛地认识到了且研发出了以树突状细胞为基础的肿瘤免疫疗法。大量实验已经证实通过接种载有肿瘤抗原的树突状细胞疫苗可以产生对抗肿瘤的免疫力[2]。然而，在肿瘤病人中有效地临床反应是有限的且尚未发现它与肿瘤特异性T细胞的诱导有直接的联系。

对特异性肿瘤抗原的认识显著地推动了肿瘤免疫治疗的进展。随着对抗原识别的分子基础的认识的提高，对肿瘤抗原特异性疫苗的合理设计得到了发展，这样的疫苗是以能与MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子结合的序列为基础。在过去的十年里，肿瘤抗原特异性多肽修饰的疫苗通过临床前期试验和临床试验已经得到了改进，且在此过程中已经开始研究一些关键的问题[3]。肿瘤疫苗中合成性多肽的应用有实用的优点，如有效地构建和生产。但是，它也限制了肿瘤特异性T淋巴细胞对多肽某些表位的免疫性识别[3]。虽然一些抗原具有肿瘤特异性(如恶性B细胞产生的独特基因型和病毒相关恶性肿瘤中的病毒抗原)，但肿瘤组织中大多数属于过量表达的或者突变了的自身抗原。利用全肿瘤细胞裂解物，肿瘤组织源性伴侣蛋白和凋亡或坏死肿瘤细胞这些物质制得的个体化肿瘤疫苗包含了多种非特异性抗原。它们能够对广泛的肿瘤抗原产生免疫作用且无需识别肿瘤特异性抗原。这对恶性进展疾病患者尤其重要，因为他们体内的免疫逃逸现象很严重[4]。

本文主要关注肿瘤免疫治疗中个体化DC疫苗领域的新进展，并探讨其在今后临床试验中的局限性和可改良之处。

1 树突状细胞肿瘤疫苗

树突状细胞在肿瘤免疫治疗中发挥主要作用，因为，其主要功能就是诱导并调节免疫反应。在一系列肿瘤特异性抗原存在条件下，体外培养获得的树突状细胞已经用于动物模型试验及临床试验。许多体外技术也已经用来产生、扩增、载入和激活树突状细胞。目前临床试验及多数动物试验所使用的树突状细胞主要来源于单核细胞源性树突状细胞(骨髓树突状细胞)。阶梯密度离心血浆置换得到的外周血单核细胞是一种主要的富集血中树突状细胞的方法，以便用于临床[5]。从病人血液中分离到的或者骨髓中获取的单核细胞在粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)存在条件下培养，经过4～5天的时间它们可分化成幼稚的树突状细胞。Flt3L也已用于树突状细胞的扩增。TNF-α、IFN-γ、LPS、CpG、IL-1或CD40L可进一步激活产生成熟的树突状细胞。CMRF-44，即CD1c，BDCA-4和其他树突状细胞特异性标志物同样用于促进树突状细胞的成熟。而且，非选择性骨髓细胞或者血液和骨髓中CD34+前体细胞也被用来获得树突状细胞。CD34+细胞可因GM-CSF的加入而被动员，反过来这又降低了对辅助T细胞(Th2)的免疫反应。树突状细胞的纯度和功能分级决定了抗肿瘤免疫反应的质量[5]，但这需要进一步的标准化。

2 选择载入树突状细胞内肿瘤抗原的来源

CD8+或CD4+T的特异性抗肿瘤T细胞的激活需要树突状细胞表达的MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子递呈肿瘤抗原。所选肿瘤抗原的性质会影响接种疫苗后免疫反应的特异性和有效性。临床试验中常用的树突状细胞被载入了从特异性肿瘤抗原获得的多肽或者DNA、RNA编码的一个或几个特征性的肿瘤抗原，这种树突状细胞在识别肿瘤组织表达的特异性抗原方面具有明显的限制性。而且，这些疫苗经常导致某一些T细胞克隆选择性扩增和表达。人们已经描绘出了正常组织和恶性组织中与恶性细胞表面多肽相结合的HLAⅠ类分子的分离和测序，这样就可以辨别出肿瘤相关抗原(TAAs)和相应的HLAⅠ类分子特异性过量表达的肿瘤病人。多种免疫原性多肽都属于TAAs(包括末端端粒转移酶，酪氨酸酶，黑色素瘤抗原基因，T细胞识别的黑色素瘤抗原，黏蛋白MUC1，癌胚抗原，p53基因，人类表皮生长因子受体Ⅱ，存活素等等)并且通常被某一HLA型所限制[6]。另一种情况是，树突状细胞也可暴露于全长蛋白这样会引起CD4+和CD8+T细胞的免疫反应。利用同源的或同源异基因的肿瘤细胞，凋亡小体，肿瘤裂解物，肿瘤RNA或DNA这些物质而获得的树突状细胞可以导致各种免疫反应，包括CD4+T细胞和细胞毒性T细胞的多种克隆。大量获得树突状细胞的其他方法，包括树突状细胞-肿瘤细胞融合，也已被证实有效。在不同的肿瘤模型可看到，相比于肿瘤裂解物修饰的树突状细胞肿瘤疫苗，由肿瘤细胞修饰的树突状细胞疫苗具有更好的有效性。人们也研发出了其他的基因学方法，如多种病毒的和非病毒的转运系统，并且Ribas[7]和Breckpot[8]等也广泛证实这一点。

树突状细胞转载技术的多样性需要进一步的比较性研究。因此，最有效的刺激树突状细胞-抗原融合与递呈的最优策略还未达成一致。但是，作为精确的肿瘤排斥抗原，从同源肿瘤细胞获得的抗原复合物优于其他方式，且对每个病人具有特异性。一项关于黑色素瘤的报道称，针对同源肿瘤细胞的T细胞反应性具有很高的个体特异性，而且这些T细胞的大部分不能够识别同种异基因肿瘤的表位，这一报道支持了这一观点[9]。

3 载入肿瘤抗原的树突状细胞的激活及体内传送

树突状细胞有效地激活肿瘤特异性T淋巴细胞需要MHCⅠ类分子或MHCⅡ类分子对肿瘤源性表位的递呈，树突状细胞协同刺激分子(例如CD80，CD86和CD40)对第二信号的传送，以及活化了的树突状细胞分泌的促炎因子的支持。现已广泛使用树突状细胞激活剂包括细胞因子(例如干扰素、TNF-α、GMCSF或IL-1β)，肿瘤坏死因子受体家族的配体(如CD40L)，或是免疫佐剂如脂蛋白配体(脂多糖，磷酸胞苷酰和poly-I:C)[1]。

由于体外培养树突状细胞的方法价格昂贵且操作复杂，若能够在原位载入并激活树突状细胞的话应用将更为简便。人们已经探索出多种能在体内将MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子结合的肿瘤抗原传递给树突状细胞并将其激活的方法。例如，将带有能与树突状细胞表面标志物(DEC205)或其他受体特意结合的抗体的肿瘤抗原注入体内。同时，促炎信号的传导保证了树突状细胞的成熟，如CD40激活的抗体或脂蛋白配体[10]。在树突状细胞成熟的过程中伴有向引流淋巴结迁移的过程，并在这些淋巴结内激活免疫T细胞。那些没有经过成熟和活化过程的树突状细胞处于一种未成熟状态，而这些树突状细胞很可能导致免疫耐受。但是目前对于应该在体内还是体外来诱导树突状细胞成熟还未达成一致观点，而且，如果认为成熟的树突状细胞比未成熟的树突状细胞有更强的激活T细胞的能力的话，那么我们考虑在体外培养成熟的树突状细胞的时期也会降低其激活T细胞的能力。另外还有利用基因工程的方法使树突状细胞表达共刺激分子和分泌促炎因子的方法[11]。

免疫接种肿瘤疫苗的部位也非常重要，接种部位要保证树突状细胞能迁移到外周淋巴器官，并在这里将肿瘤抗原递呈给T细胞。许多种接种方法是将疫苗接种到皮内或皮下，这样会严重降低疫苗的效果，因为这样只有5%～10%的细胞可以迁移到外周淋巴结。我们可以通过预先使用脂蛋白配体或促炎因子的方来提高树突状细胞的迁移能力，脂蛋白配体还可以在体内促进树突状细胞的迁移能力，促炎因子可以促进树突状细胞表达CCL21，及CCR7的配体以促使细胞向外周淋巴结迁移。有研究者报道了直接真皮内或静脉内注入疫苗的利处，某些肿瘤组织本身也有作为注射部位的可能性[12]。

通过利用抗凋亡亚家族分子BCL-2或BCL-xL转染树突状细胞以提高其存活也是很重要的一部分内容，因为，这样可以延长树突状细胞在体内的存活时间来更好地启动肿瘤特异性T细胞的激活并维持这种激活状态。

因此，选择最合适的树突状细胞亚群及用以活化树突状细胞活化的信号性质对于有效的抗肿瘤免疫反应是很重要的。但是，载入树突状细胞内的肿瘤抗原的性质对肿瘤疫苗的临床有效性才是更为关键的。

4 现阶段的个体化树突状细胞疫苗

4.1 肿瘤细胞修饰的疫苗

正如前面提到的，采用特异性肿瘤抗原肽修饰的树突状细胞的一个重要不足之处就是它只能将很少种类的HLA-结合表位递呈给T细胞。这就导致了只能诱导有限的肿瘤特异性T细胞克隆进而导致肿瘤免疫逃逸突变的出现。利用全肿瘤制剂(凋亡或坏死的肿瘤细胞或肿瘤裂解物)获得的个体化肿瘤疫苗也许会克服上述问题，因为这样的疫苗涵盖了大量的已知的或未知的抗原来激活多克隆性的免疫反应。因此在理论上，经坏死的全肿瘤细胞修饰的树突状细胞可将肿瘤的所有抗原成分递呈给免疫系统这一优点。这种方法对于获取的病人的肿瘤组织拥有更强的特异性。然而，对于使用哪种死亡的肿瘤细胞(凋亡细胞，坏死细胞或全细胞裂解物)来修饰树突状细胞仍有争议。有些人提出利用裂解物的方法获得的免疫力较低可能是因其包含免疫抑制因素[13]。实际上，疫苗制剂中大部分的TAAs也是机体自身抗原，诱发自身免疫的风险也得到了人们的关注，尤其当全肿瘤细胞制剂作为抗原来源的时候。例如，在某些试验中，在对黑色素瘤患者注射疫苗后会出现白癜风，重要的是这关系到临床反应和治疗结果的好坏[14]。利用自身肿瘤细胞获得的抗原来修饰树突状细胞的主要不足是施行较为困难。通过活组织检查取得的肿瘤组织标本因其量太少而很难用于治疗，尤其是当需要多次免疫治疗时(这一问题可通过肿瘤RNA扩增解决)。

已有报道称在不同的临床试验中，利用全肿瘤细胞制剂获得的树突状细胞疫苗显示出有效的抗肿瘤免疫力及临床反应。O’Rourke等证实给进展期黑色素瘤病人注射自体肿瘤细胞修饰的树突状细胞疫苗能够获得持久的完全性的免疫反应[14]。在完成所有治疗计划的12个病人当中，3个能保持持久的完全缓解(平均持续时间为35个月)，3个有部分缓解，剩余6个病人的病情则发生进展。而且，在肾癌病人中，经肿瘤细胞裂解物修饰的树突状细胞疫苗也被证实了有临床疗效。在27个评估病人当中，2个完全缓解，1个部分缓解，还有7个病情稳定[15]。关于前列腺癌树突状细胞免疫治疗的临床试验也取得了令人鼓舞的结果(Thomas-Kaskel等综述)。在这项临床试验中接近500名前列腺癌患者接受了载有肿瘤抗原的树突状细胞疫苗的治疗，其中2/3的患者有免疫反应，近一半的患者有临床反应[16]。

4.2 独特型疫苗

利用肿瘤细胞或肿瘤细胞的抗原成分来免疫患者,以使患者获得肿瘤特异性免疫力的这种方法已经成功地应用于血液学恶性疾病。B细胞恶性肿瘤是由一种B细胞克隆异常扩增引起的，这种B细胞表达的免疫球蛋白有一个特殊的可变区。因此，这样的可变区可以看作是一种肿瘤相关抗原并作为临床免疫治疗的靶点。因为同源的可变区是个体特异性的，要单独为每一个病人准备各自的疫苗，也因此独特型疫苗的应用受到限制。针对可变区制备的单克隆抗体部分解决了这一问题并且能够使肿瘤获得长期的完全缓解。但是一些患者会对这种疗法产生耐受，是因为可变区再次发生突变而不再表达能被抗体识别的抗原表位。同时，通过肿瘤可变区制得的疫苗会诱导出长期的多克隆的体液和细胞免疫反应以对抗肿瘤。B细胞淋巴瘤的肿瘤特异性可变区可通过与骨髓瘤细胞系融合而复活。这些杂交瘤细胞能分泌肿瘤源性的免疫球蛋白，再通过纯化可制备成疫苗。但是，这些免疫球蛋白属于自身蛋白，只诱导出对抗可变区的免疫反应是很困难的。因此，人们做了很多实验来研究怎样能使这种树突状细胞疫苗可以辨别性地摄取抗原并递呈给免疫系统。Timmerman等在35个B细胞淋巴瘤患者中评估了免疫球蛋白可变区修饰的树突状细胞疫苗的效果。其中包括10个有可测病灶的初发患者，结果显示，8个病人有抗可变区的T细胞增殖反应，4个有临床反应，2个完全缓解，1个部分缓解，还有一个有分子学缓解。另外25个患者是在初次化学治疗之后接种疫苗的，23个患者完成了整个治疗计划，其中的15个患者出现了抗免疫球蛋白的T细胞或者体液免疫反应[17]。

与淋巴瘤不同的是，骨髓瘤细胞将免疫球蛋白的可变区分泌到血浆当中，且作为独特型疫苗免疫治疗的靶点，恶性浆细胞只是低表达可变区蛋白。但也有报道称，在多发性骨髓瘤患者中，在接种了免疫球蛋白可变区蛋白修饰的树突状细胞疫苗以后也能产生对抗肿瘤的T细胞免疫反应(17个患者中有3个完全缓解，2个部分缓解[18]。

4.3 伴侣蛋白修饰的疫苗

科研人员在证实了肿瘤细胞裂解物或坏死肿瘤细胞的免疫原性与伴侣蛋白家族(热休克蛋白)的成员相关之后，研发出了肿瘤热休克蛋白修饰的疫苗。伴侣蛋白可作为多种肿瘤抗原多肽的载体而具有特异性免疫原性。它们也是能激活树突状细胞的天然免疫佐剂。我们的工作小组和其他人员都已经证实机体内纯化的伴侣蛋白—热休克蛋白70，热休克蛋白90，Grp蛋白94/gp96和肌钙网蛋白都能对同源的肿瘤产生免疫反应[19]。这样的疫苗只对从中获得伴侣蛋白的肿瘤具有特异性，那是因为通过一种肿瘤制备得到的疫苗不能对其他起源的肿瘤产生作用。免疫学对热休克蛋白修饰的疫苗的认定是依赖于疫苗至少能与某些伴侣蛋白和预想的抗原肽指纹(speculated 'peptide antigen fingerprint')结合，而后者在肿瘤之间是不同的。热休克蛋白70和Grp94蛋白/gp96目前已应用于临床试验。

在这一免疫学领域内，我们的实验室已经研发出一种新型的抗癌疫苗，叫做富伴侣蛋白细胞裂解物(CRCL)。这种疫苗是通过非液相等电聚焦技术(FE-IEF)利用肿瘤细胞裂解物使伴侣蛋白的数量增多而不是将其纯化。CRCL包括热休克蛋白90和热休克蛋白70家族成员，内质网伴侣蛋白GRP94/gp96和肌钙网蛋白，除此之外还有热休克蛋白40，热休克蛋白60，GRP75和GRP78。CRCL保留了未分离裂解物中免疫性组分而去除了可能具有免疫抑制性的因素，并将裂解物制剂的高产率、相对简单性和扩大了的伴侣蛋白的抗原性结合于一身。相比于任何个体的伴侣蛋白只用作疫苗而言，每一单位这样的疫苗具有更加显著的免疫作用。FE-IEF相对较简单，快速且有效，每克肿瘤组织就能获得1～2mgCRCL疫苗。若是同样质量的肿瘤组织，用目前临床试验传统地纯化得到的热休克蛋白(如热休克蛋白70和GRP94/gp96)，FE-IEF法是其10～25倍。以临床的观点看，这种技术可以用有限的肿瘤组织以高产率获得多种伴侣蛋白，并且缩短了评价治疗效果的报告时间。CRCL向树突状细胞提呈肿瘤抗原并且作为免疫佐剂还可以激活树突状细胞(表达T细胞激活所必须的CD40，CD80/86和CD70等共刺激分子)。我们最近发现，与CRCL调节的树突状细胞的激活相关的分子信号事件也包括MAP激酶通路，是因为ERK1/2和p38的磷酸化，转录因子NF-kB的激活，以及STAT1、STAT5、AKT的磷酸化都有所增加。有趣的是，进一步使用这种疫苗会发现它会抵抗调节性T细胞和TGF-β调节的免疫抑制。在一系列小鼠的肿瘤中也证实了CRCL的有效性，如12B1(鼠BCR-ABL阳性白血病)、A20淋巴瘤(鼠B细胞淋巴瘤)、B16(鼠黑色素瘤)和TUBO(鼠乳腺癌)。而且，人类卵巢癌源性的CRCL也被证实对树突状细胞的激活作用是优于肿瘤裂解物的，人类卵巢癌源性CRCL修饰的树突状细胞能诱导产生肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞[20]。因此，CRCL修饰的树突状细胞可以提高疫苗的免疫原性，表明CRCL可作为个体化树突状细胞抗癌免疫治疗的抗原来源之一[13]。

5 目前树突状细胞疫苗的使用限制及联合用药策略

虽然我们已经取得了很多令人鼓舞的成果，但是很多临床试验也证明了在临床上树突状细胞免疫疗法不足以产生足够的疗效及持续性的抗肿瘤反应。导致这样结果的部分原因也许是接受治疗的终末期患者的严重病情所致。而且，肿瘤在进展的过程中会在体内产生免疫抑制作用从而很大程度上改变了免疫系统的功能。肿瘤组织可以通过多种机制产生免疫调节从而反过来影响树突状细胞的功能。其造成的结果是，即便在体外能很好的将抗原载入树突状细胞并将其扩增，在体内，疫苗的功能也会因肿瘤环境而造成很大的影响。肿瘤实质细胞或基质细胞合成的一些生物活性物质(如TGF-β、IL-10、IL-13、VEGF、2，3-吲哚胺二氧酶和PGE2)会对免疫系统产生抑制作用。肿瘤源性的因素就像骨髓中的抑制细胞一样能影响树突状细胞的分化，使未成熟的树突状细胞，类浆细胞树突状细胞(MDSCs)和抑制性调节免疫体统的树突状细胞增多。在患有肿瘤的小鼠体内，脾脏和淋巴结中一些调节性树突状细胞的累积会产生CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞，从而降低树突状细胞疫苗的疗效。

所以，如果树突状细胞免疫治疗能和那些针对免疫耐受的治疗方法(对免疫抑制分子或细胞的抑制，如TGF-β，调节性T细胞，MDSCs等等)联合应用的话会提高树突状细胞疫苗的临床疗效。例如，一些TGF-β拮抗剂(中和性单克隆抗体、融合蛋白、TGF-β反义寡核苷酸链)和TGF-β受体激酶抑制剂就能加强由抗原修饰树突状细胞疫苗和过继T细胞治疗诱导的抗肿瘤免疫反应[21]。与此观点一致的是，免疫毒素如ONTAK和LMB-2可以通过选择性减少调节性T细胞和刺激辅助T细胞、细胞毒性T细胞来提高肿瘤抗原修饰的树突状细胞疫苗的免疫刺激作用[22]。这种调节性T细胞的耗竭已在临床肾癌和黑色素瘤患者中见到。环磷酰胺通过清除或去活化抑制性T细胞以便于对肿瘤施行过继免疫疗法。我们在最近报道，一种用于治疗鼠BCR-ABL+髓性白血病的化学药物，imatibib mesylate，能在淋巴瘤模型中提高全肿瘤细胞裂解物修饰的树突状细胞疫苗的疗效。这种协同效应是因该药物抑制了调节性T细胞并刺激了CD4+和CD8+T细胞。我们还证实了此药和载入CRCL的树突状细胞可更高效地治疗白血病[23]。因此，联合治疗是提高个体化树突状细胞疫苗疗效的关键所在。

6 结论与展望

人们对肿瘤免疫治疗中树突状细胞疫苗的研究与试验已有十余年。其设计、改良已取得很大的进步。值得关注的是，在临床前期试验和临床试验中树突状细胞治疗的副作用是微乎其微的。在多种肿瘤患者已经检测到肿瘤抗原修饰的树突状细胞能发挥特异性免疫反应，但是，也存在多数接种疫苗的患者肿瘤未能缓解，这也打击了树突状细胞免疫疗法。导致这一现象的原因可能是进展期肿瘤患者尤其是终末期病人产生的免疫耐受现象。若个体化树突状细胞疫苗能够包含肿瘤组织中所有的抗原的话也许会解决部分免疫抑制现象而且能广泛激活特异性抗肿瘤T细胞，如多克隆免疫反应会阻止免疫逃逸突变的发生。然而个体化树突状细胞疫苗应用最大的障碍是通过活检获得的肿瘤组织的量太少以至于不能获得足够的疫苗制剂，尤其是需要多次免疫治疗时。可以在体外增殖肿瘤细胞以获得足够的数量，然而培养过程中肿瘤细胞的特性也许会发生改变。

肿瘤免疫治疗未来的方向是解决肿瘤引起的免疫抑制现象，而使树突状细胞疫苗发挥最大的治疗效果。这一目标的实现离不开联合治疗策略，个体化树突状细胞疫苗与化学治疗性药物的联合使用不仅能直接靶向针对肿瘤细胞，还能清除或减少免疫抑制细胞或因子的功能。这些方法仍需进一步的评价与标准化，它们也许会显著提高肿瘤免疫治疗的总体效果。

7 总结

7.1 树突状细胞疫苗有效诱导抗肿瘤免疫反应

对肿瘤抗原性质的选择关系到疫苗发挥免疫反应的特异性与有效性

特异性肿瘤抗原多肽产生有限的T细胞克隆，这也许会导致肿瘤逃逸突变的出现

个体化肿瘤疫苗诱导的针对多种肿瘤抗原的多克隆免疫反应可能会阻止肿瘤逃逸突变的发生

7.2 个体化树突状细胞抗肿瘤疫苗

全肿瘤细胞，肿瘤细胞裂解物和凋亡的肿瘤细胞

独特型疫苗

个体伴侣蛋白(如热休克蛋白)

多伴侣蛋白裂解物(富集伴侣蛋白细胞裂解物)

7.3 局限性与联合治疗

从患者个体只能获得有限数量的疫苗原料和肿瘤组织

在进展期患者体内肿瘤诱导的免疫耐受会影响树突状细胞的功能疗效

联合性化学-免疫治疗策略可能会解决免疫抑制而提高树突状细胞免疫治疗的疗效

8 结论

个体化肿瘤免疫治疗在阻止免疫逃逸突变方面优于多肽疫苗

个体化树突状细胞疫苗安全可靠且能够针对多种肿瘤特异性抗原产生多克隆免疫反应

树突状细胞的化学-免疫联合疗法能显著提高肿瘤病人的治疗效果

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