流式细胞术在肿瘤免疫学中的应用

河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室 刘 亮

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞定量分析和分选的新技术，能定量分析细胞的生物化学成分。其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、RNA、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析，为细胞生物学和生物医学的研究提供了强有力的手段。80年代时，流式细胞术就已经广泛应用于基础和临床医学的研究，已成为切实可行有效的研究方法，同时在医学领域中也得到了广泛推广应用，在免疫学、细胞遗传学、肿瘤、病理学、放射生物学等学科，并形成了独特的学科分支，诸如流式免疫学、流式遗传学、流式病理学、流式细胞酶学等。

近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，对细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展，很多学者将流式免疫检测技术用于临床医学，对疾病的诊断、治疗、预后评价都起了重要作用。流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使 FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为 FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径，新的肿瘤标志物的出现，大大提高了FCM在医学领域的研究水平，其发展速度之快，应用层出不穷。

肿瘤尤其是恶性肿瘤成为目前威胁人们生命健康的主要疾病，肿瘤的早期诊断及治疗对于提高患者的预后及生存期具有重大的意义，肿瘤的早期缺乏典型的形态学表现，这样就给常规的病理检测，进行早期诊断带来了困难。肿瘤标志物的出现给肿瘤早期诊断带来了新的曙光。流式细胞术对于肿瘤标志物的检测具有客观、检测速度快、操作简便、数据精确等优点，适合于肿瘤标志物的检测，有效提高肿瘤早期诊断的正确率。流式细胞术之所以能够检测肿瘤标志物，得益于流式细胞术与免疫学的结合形成的流式细胞免疫学。

流式免疫技术是研究以单细胞或单细胞核为基础，并结合传统的免疫学方法，其基本原理是细胞上的抗原与相关的单克隆抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物，通过流式细胞术测定其特定荧光量。目前流式免疫学染色方法有直接免疫荧光标记法和间接免疫荧光标记法，推荐使用直接免疫荧光标记法，具有测定结果准确，操作简便等优点。现就流式细胞术在肿瘤免疫学中的应用分述如下。

1 肿瘤基因蛋白产物的流式细胞术检测

恶性肿瘤是一种多基因异常的疾病，它发生的分子基础是原癌基因的激活和或抑癌基因的失活，导致某些细胞分化不良和增殖失控而形成肿瘤。目前研究发现，某些癌基因及抑癌基因蛋白可以作为肿瘤标志物用于肿瘤早期诊断。大量的与荧光素标记的癌基因及抑癌基因蛋白单克隆抗体的出现，也使得流式细胞术在肿瘤基因蛋白产物的检测中得到了广泛的应用。

癌基因是指一大类促进细胞分裂增殖，并具有潜在致癌或促癌作用的基因群，已发现的癌基因有：myc基因族，包括C-myc、N-myc、L-myc；ras基因族；fos、c-sis、c-abl、c-src、c-erbB-2等，抑癌基因则是一大类抑制细胞生长，对细胞增殖起负调节作用，并能潜在抑制癌作用的基因，包括DCC、NF-1、NF-2、RB、野生型p53、p16等，某些基因针对某种特定的组织或细胞才有意义，即各种组织来源的癌，应有它特定的癌基因谱或抑癌基因谱，也有组织特异的基因群。

c-erbB-2基因，又称neu基因，该基因通过蛋白产物的过度表达而与参与人类肿瘤发生。有研究报道，c-erbB-2基因蛋白在乳腺癌中高表达，除此之外，它还与卵巢癌、宫颈癌、胃癌、唾液腺癌、食管癌及膀胱癌等多种肿瘤有关。突变型p53基因属癌基因，它与结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌和白血病等有关。Rb基因蛋白与视网膜母细胞瘤、成骨肉瘤、软组织肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌等有关。

利用抗基因蛋白产物的单克隆抗体对基因蛋白的表达进行研究，流式细胞分析技术在肿瘤发生的分子机制研究方面有了很大进展，从分子水平极大的推动了对恶性肿瘤发生、发展的研究进展，并对肿瘤的诊断、预后检测提供有用的标志物。

2 淋巴造血系统恶性肿瘤流式免疫表型分析

2.1 急性淋巴母细胞白血病免疫表型分析

急性淋巴母细胞白血病(ALL)的免疫学分类进展较快，其重点主要在于确定ALL的细胞来源和其成熟的阶段。目前，对ALL尚无统一的分类标准，许多学者使用细胞特异性单克隆抗体辅以基因重排研究将ALL分为B细胞性、T细胞性和未分类ALL三种。流式细胞术对细胞上特异性表达的抗原进行检测从而为ALL的分类提供诊断依据。

B细胞性ALL，CD19是ALL免疫表型分析最具价值的B细胞限制性单抗，是B细胞系统最早出现的特异性膜抗原，其出现早于CD10和CD20，且在浆细胞期以前持续存在。正常及恶性T细胞或髓性单核细胞无CD19表达。T-ALL的免疫表型可表现为胸腺细胞成熟过程的三个阶段中任意阶段的变化，不同阶段有不同CD分子表达，但不管是处在哪一阶段，几乎均有CD7特异抗原的表达。现在已有不同荧光素标记的不同的CD的单克隆抗体，可以利用流式细胞术对其进行精确、快速的测量，为ALL的分类提供诊断依据。

2.2 恶性淋巴瘤的流式细胞术免疫表型分析

使用荧光素标记抗体的FCM细胞检测已成为淋巴细胞免疫表型分析的一种有效方法。通过对淋巴细胞表面抗原进行连续性评价可弄清淋巴细胞分化过程各步骤抗原表达情况。据此可准确确定具有异常表型的淋巴细胞，这类淋巴细胞往往是恶性肿瘤细胞。一个单一表型淋巴细胞群体的检出表明某一淋巴细胞亚群的单克隆性增生，这是恶性淋巴瘤的特征。何杰金淋巴瘤由于含有大量的非肿瘤成分，免疫表型的分析意义不太大，其研究工作多限于RS细胞的来源等方面，流式细胞术常用于非何杰金淋巴瘤免疫表型分析。如恶性淋巴瘤，小淋巴细胞型，典型者膜IgM和CD5、CD19、CD20、CD24以及HLA-DR抗原呈阳性表达；弥漫性恶性淋巴瘤，小核裂和混合细胞型，免疫表型常表现为CD19、CD20、CD22阳性，有时CD21和CD24阳性。但通常无CD10的表达。

随着不同荧光染料标记的多种CD抗体的出现，流式细胞术已成为淋巴造血系统恶性肿瘤免疫表型分析的强有力的工具。

3 T淋巴细胞及其亚群免疫标记

T淋巴细胞是机体免疫系统功能最重要的一大细胞群，在免疫应答过程中，末梢血T细胞发育为功能不同的亚群，在正常机体内，各亚群的数量和功能发生异常时，就可能导致机体免疫紊乱并发生一系列的病理变化。

目前，越来越多的研究表明，T淋巴细胞亚群在各种临床疾病(如造血系统疾病和恶性肿瘤等)都有异常改变，在各种疾病的发生、发展过程中用不同的T淋巴细胞表型标志物来测定人外周血中T抑制(T8)和T辅助(T4)淋巴细胞亚群比例T4/T8来评价体内细胞免疫调节平衡状态，测定T亚群的相对标记率，可以帮助研究各种与免疫有关的疾病发病机制，特别是T细胞的免疫调节功能，所以，它可以作为临床免疫研究的手段，成为临床检验的一项重要指标。细胞免疫功能与恶性肿瘤的发生、发展及复发具有一定的关系，有研究发现，恶性肿瘤患者免疫功能低下，表现为T4细胞百分率降低，有甚者出现T4/T8比值倒置的现象，且在复发肿瘤患者中也检测出细胞免疫功能低下的现象。目前已有较多的不同荧光素(FITC、PE、ECD等)标记的CD3、CD4、CD8等抗体，可以应用流式细胞术进行检测，从而对免疫功能进行评价。随着标准参考样品在流式细胞术检测中的使用，目前流式细胞术不仅可以检测出CD3、CD4、CD8等阳性细胞占淋巴细胞中的百分率，而且可以检测出T抑制(T8)和T辅助(T4)淋巴细胞亚群绝对数量，为患者免疫功能的评价提供更加精确的数据，指导患者临床用药。

4 血小板膜表面受体的标记

血小板是巨核细胞分化成熟后，巨核细胞质裂解脱落的小块细胞质，它的最表层富含糖蛋白和一些酶，是血小板表面特异吸附的血浆成分，也是血小板黏着、聚集的反应部位，血小板膜上含有多种与凝血有关的因子，在止血、凝血、维持血管内皮的完整性方面具有重要的生理功能，血小板数量和机能的异常都可以引起释放反应异常及反应无力症，其反应异常表现为血小板对ADP、肾上腺素、胶原等诱聚剂的作用形成聚集后，不能释放ADP及PFs等，如在血小板无力症患者中血小板膜上的糖蛋白2b-3a复合物先天缺陷会导致其血小板聚集功能障碍。

目前认为，与血小板有关的血小板膜受体有2b、3a、2b-3a复合物，1b、VWF、GMP-140、Fg等，其检测方法不尽相同，有SDA-PAGE法，交叉免疫电泳法，这种方法难于检出较低含量的膜受体，而免疫印迹法的灵敏度虽较高，但标本用量大，操作复杂耗时长，膜纯化过程中受体变化大，易丢失等原因，临床实验室较少应用，放免法易受其他细胞的干扰或一个抗原分子结合多个抗体而导致测定结果偏高等缺点，而流式细胞术检测血小板膜受体，是分析血小板方法学上的重要进展，它从分子水平诊断血小板功能和数量的异常，方法操作简便、快速、特异和准确度高，重复性好，且标本的用量少，能灵敏地从大量血小板中检出2%受体阳性或阴性的血小板。因此，流式细胞术测定血小板膜受体数量和功能很适合作为临床检验。

近年来，随着流式细胞术相关技术的不断发展，尤其是荧光素标记的新型抗体的不断问世，使得流式细胞术在肿瘤免疫学中得到了广泛的应用，对于肿瘤的早期诊断、判断预后、监测治疗效果等方面具有重要的意义。流式细胞术在生物医学中将具有广泛的应用前景。