重组人p75NTR169－Fc抗酶裂嵌合体在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

景丽玲 王 欣 陈 虹 张俊文

p75NTR(neurotrophins receptor，p75)属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，最初被认定是神经营养素(neurotrophins，NTs)的“通用”受体，但随着对其研究的深入，发现 p75NTR可以和不同的配体，如proNGF、β －淀粉样肽(beta amyloid，Aβ)以及和共受体，如Trk，NgR及Sortilin等结合，不仅介导神经元的存活、分化、轴突的生长，还可以介导神经元的死亡［1～3］。p75NTR 与 sortilin 作为 proNGF(proneurotrophins)的受体介导细胞死亡［4］。近年来在神经退行性疾病的研究中，p75NTR作为Aβ的受体越来越引起关注［5～7］。在神经退行性疾病动物模型中，上调p75NTR的水平，导致更多的神经元凋亡。海马和大脑皮质的胆碱能神经元丢失是AD发病的早期特点，而这些神经元都是高表达 p75NTR的［8］。将 Aβ作用于从p75NTR基因敲除小鼠分离得到的海马神经元，与Aβ作用于富含p75NTR的海马神经元相比，Aβ不能引起p75NTR基因敲除的海马神经元的凋亡却能引起富含p75NTR的海马神经元的凋亡［5］。因此，p75NTR已成为研究治疗神经退行性疾病如阿尔茨海默病等的一个热点。

研究显示，p75NTR是通过胞外区结构域和配体结合，胞内区结构域激活介体(mediators)而发挥效应［9～11］。笔者曾经用毕赤酵母成功的表达过p75NTR194－Fc重组蛋白，但发现该重组蛋白的纯化产物中大部分为其蛋白酶降解产物，氨基端氨基酸顺序测定证实:蛋白酶切位点位于p75NTR 170位氨基酸。因此，本研究中，我们重新表达了由p75NTR胞外区1～169位氨基酸构成的p75NTR169与人Ig G Fc融合的重组蛋白。该重组蛋白特点为:①保留了p75NTR配体结合区，删除掉蛋白酶解位点，将不再有因为酶裂产生的低分子质量p75NTR－Fc融合蛋白;②融合人IgG Fc片段后将延长重组蛋白半衰期并方便蛋白纯化。重组蛋白p75NTR169－Fc的生物活性实验研究显示:该重组蛋白能够抵抗 Aβ(25－35)对PC12的细胞毒作用，抑制由NGF刺激引起PC12细胞轴突的生长，具有同NGF抗体相同的效果。

材料与方法

1．材料:大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞系，购自北京协和医学院细胞中心，培养液为含有5%马血清及10%胎牛血清的RPMI 1640(Hyclone公司产品)。大肠杆菌菌株DH5α，用于质粒的扩增和转化;大肠杆菌菌株BL21(DE3)是pET系列质粒表达的宿主菌，质粒pET－28a(+)系蛋白表达载体，均由本室保存。Aβ(25～35)购自 Sigma公司;纯化基质 HiTrap rProtein A FF购自GE公司;神经生长因子NGF为R＆D公司产品;兔源多克隆抗p75NTR抗体购自ABCAM公司;兔源多克隆抗NGF抗体购自Santa Cruze公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。所有引物及基因测序由北京奥科生物有限公司完成。

2．方法:(1)p75NTR169的胞外区、IgG重链铰链区和Fc区结构域基因的扩增和拼接:参考 Gene Bank中已知的p75NTR全序列，用软件Oligo分析后设计如下一对引物:上游引物:5'－TATACCATGG GCAAGGAGGCATGCCCCACAG－3'(含NcoⅠ识别位点);下游引物:5'－tgg gca tgt gtg agt ttt gtc TGT AAT CCA ACG GCCAGG－3'(小写字母示IgG铰链区顺序，大写字母示p75NTR顺序)。免疫球蛋白IgG重链恒定区Fc的 DNA片段(216～443)顺序源自文献(Capon．D．et al．Nature，1986，337:525～531)，其上游引物 P216:5'－GAC AAA ACT CACACA TGCCCA C－3'，下游引物P433:5'－ TCGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG－3'(含EcoRⅠ识别位点)。以本组保存的pUC12－NGFR和人肝cDNA为模板，用上述引物分别扩增出p75NTR(1～169)，Fc(216～433)基因顺序，再按照重叠PCR的原则和方法，将两组扩增产物混合变性、复性后再扩增，得到p75NTR(1～169)－Fc(216～433)融合基因，缩写为p75NTR169－Fc(图1)。(2)原核表达质粒pET28a－p75NTR169－Fc的构建:将上述融合基因p75NTR169－Fc经NcoⅠ、EcoRⅠ酶切和回收，与经 NcoⅠ、EcoRⅠ酶切的载体pET28a(+)，在T4 DNA连接酶作用下连接，连接产物转化感受态细胞DH5α，挑选阳性克隆、重组质粒酶切鉴定，测定克隆片段核苷酸序列。(3)重组蛋白p75NTR169－Fc表达、纯化、超滤、除菌及定量:重组质粒转化宿主表达菌BL21(DE3)，涂铺于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。挑选单菌落接种于含有卡那霉素的2ml LB培养基中，37℃，250r/min振荡培养过夜，按1∶100的比例接种到含卡那霉素的新 LB培养基中，37℃，250r/min振荡培养2h，至 OD600在 0．5～1．0之间，加入 IPTG至终浓度为1mmol/L，于不同温度诱导表达12～18h。8000r/min离心10min收集菌体，加入细菌裂解液，超声破碎，12000r/min离心15min，收集上清和沉淀，SDS－PAGE凝胶电泳及Western blotting检测。利用AKTA层析系统以protein A亲和层析柱纯化样品，全程低温操作以防止蛋白降解。上样前，上清需经0．45μm微孔膜过滤。亲和层析操作:用结合缓冲液(20mmol/L PBS，pH 7．0)以1ml/min的流速平衡亲和柱;将过滤后的上清样品以0．6ml/min的流速上样，再用结合缓冲液以1ml/min清洗，直至基线，然后用洗脱缓冲液(0．1mol/L glycine－HCl，pH2．5)洗脱，收集洗脱峰，收集管中预先加入1mol/L，pH9．0 Tris－ HCl 80 ～100μl/ml。将纯化后的样品倒入超滤管中，4℃离心30min，转速不超过6000r/min，将蛋白样品压缩至约5ml，加入PBS离心，重复2～3次，逐步更换缓冲液。0．22μm微孔膜过滤除菌，BCA方法定量，小量分装，－80℃保存。(4)重组蛋白p75NTR169－Fc基于细胞的功能实验:1)重组蛋白p75NTR169－Fc干预β－淀粉样肽Aβ(25～35)对PC12细胞毒的作用:以100μl，约1×104细胞/孔将PC12细胞接种在96孔板中培养，细胞贴壁后分别进行如下分组处理，A组:24h后，以1∶10体积加入终浓度为10μmol/L、5μmol/L、1μmol/L Aβ(25～35)作用细胞 24h，不含 Aβ(25 ～35)的为对照组;B组:24h后，以1∶10体积加入p75NTR169－Fc融合蛋白，终浓度为 1.2μmol/L、0.9μmol/L、0.6μmol/L、0.3μmol/L、0.1μmol/L，0μmol/L;C 组:24h 后，以1∶10体积加入终浓度5μmol/L Aβ(25～35)与不同浓度的p75NTR169－Fc(分别为 0、0．1、0．3、0．6、0．9、1．2μmol/L)。每组设 5 个平行孔，24h后进行MTT检测。2)p75NTR169－Fc重组蛋白阻止NGF引起的PC12细胞分化:以100微升/孔，约5×103细胞/孔接种PC12细胞于96孔板中培养。细胞贴壁约24h后，以1∶10体积加入终浓度50ng/ml的NGF与不同浓度的NGF抗体或 p75NTR169 － Fc(分别为 0、12．5、50、100ng/ml)，设100ng/ml的p75NTR169－Fc及正常培养的PC12细胞为对照组，每组3个平行孔。48h后每组随机选取视野拍照。(5)Aβ(25～35)的准备:1mg的Aβ(25～35)用高压灭菌的去离子水溶解配成终浓度200μmol/L，－20℃存放。使用前在37℃温育24h。

3．统计学方法:采用SPSS18．0统计软件进行单因素方差分析，计量资料用均数±标准差)表示，P ＜0．05表示差异有统计学意义。

结 果

1．重组蛋白基因的获得、在原核中的诱导表达及亲和纯化:p75NTR包括胞外区(extracellular domain，ECD)、茎区、跨膜区(transmembrane，TM)、胞内区(intracellular domain，ICD)4 区(图 1A)，p75NTR194－Fc含有170位氨基酸的蛋白酶裂位点(图1B)，而p75NTR169－Fc保留了完整胞外区和部分茎区的共169个氨基酸，是由人IgG的铰链区链接Fc段融合而成，该重组蛋白不含有p75NTR 170位氨基酸以后顺序(图1C)。

图1 抗酶裂嵌合体p75NTR169－Fc的设计

按照重叠PCR的原则和方法，将两组扩增产物混合变性、复性后再扩增，得到预期大小(1188bp)p75NTR169－Fc融合基因，如图2A。融合基因插入到表达载体pET28a(+)后，重组质粒经酶切及DNA测序证实片段的大小、碱基序列和读码框正确。表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，SDS－PAGE电泳，发现在约50kDa大小处有一特异表达条带，见图2B。为进一步验证箭头所指条带为p75NTR169－Fc重组蛋白。经anti－IgG抗体及anti－p75NTR抗体进行Western blotting鉴定，50kDa特异条带确实为重组蛋白，见图2C。从图2B可见，蛋白的可溶性表达在25℃及37℃没有明显差异，所以在以后试验中，我们选择室温条件(约25℃)诱导表达。诱导表达的细菌裂解上清液经protein A亲和层析柱纯化，将分步收集到的蛋白进行SDS－PAGE电泳，银染鉴定，如图2D，可见纯化后杂蛋白较少，凝胶扫描纯度分析所得产品纯度可达到96%。

图2 重组蛋白基因的获得、在原核中的诱导表达、Western blotting鉴定及亲和纯化

2．p75NTR169－Fc重组蛋白抑制 Aβ(25～35)寡聚肽对PC12的细胞毒作用:根据文献报道，Aβ通过p75NTR促进细胞的凋亡［5～8］。本研究中，我们通过MTT检测Aβ(25～35)寡聚肽对PC12的细胞毒性，发现 PC12 暴露于 10μmol/L 和 5μmol/L Aβ(25～35)24h后，细胞活性显著下降，与不加 Aβ(25～35)的对照组相比，Aβ(25～35)引起的细胞凋亡有显著性差异(10μmol/L，5μmol/L:P ＜0．05)，如图3A;单加0．1～1．2μmol/L的 p75NTR169－Fc重组蛋白对PC12细胞活性没有明显的影响(P＞0.05)，如图3B;如加入5μmol/L的 Aβ(25～35)，同时又加入不同浓度的p75NTR169－Fc，与只加5μmol/L Aβ(25～35)的对照组相比，0．6μmol/L 至 1.2μmol/L p75NTR169－Fc均能抑制Aβ(25～35)引起的细胞凋亡，具有统计学意义(p＜0．05)，如图3C。每组实验重复3次以上，证明p75NTR169－Fc对 Aβ(25～35)寡聚肽引起的PC12细胞毒性有抑制作用。

图3 p75NTR169－Fc重组蛋白抑制Aβ(25～35)寡聚肽对PC12细胞的毒性作用

3．p75NTR169－Fc重组蛋白能够中和NGF引起的PC12细胞分化:NGF与p75NTR及TrkA结合可以促进细胞的分化，NGF抗体与NGF结合阻止其与受体相互作用。PC12细胞易分化，表现为细胞从圆形的半贴壁变为多边形或锥形的贴壁细胞，实验中，与只加培养基的对照组相比(图4B或图4C)，加入NGF可以明显的引起PC12细胞体积变大并产生神经突起，长度可以达到细胞直径的3倍，如图4A;加入NGF与不同浓度的NGF抗体后，可以观察到NGF引起的PC12细胞分化受到不同程度的抑制，如图4D～F;加入 NGF与不同浓度的重组蛋白p75NTR169－Fc后，也可以观察到NGF引起的PC12细胞分化受到明显的抑制，如图4G～I。

图4 p75NTR169－Fc重组蛋白对NGF引起的PC12细胞分化的影响 (×100，48h)

讨 论

β－淀粉样肽［Aβ(40～42)］是一种神经毒性多肽，在AD病变中起到了主导作用［13］。它的低聚物是Aβ最强毒性形式，导致AD患者突触传导中神经元死亡、神经炎性病变和功能障碍［14］。脑中 Aβ的水平，是通过淀粉样前体蛋白(APP)分解产生的，正常生理状态下，新产生的Aβ与经过酶降解和运输清除掉的Aβ维持在一个动态平衡水平［15］。在神经退行性疾病的细胞研究模型中，上调或通过配体激活p75NTR 都 可 以 导 致 神 经 元 的 死 亡［8］。Aβ 与p75NTR结合后，其胞内区激活下游信号分子如JNK，NF－κB等以及介导tau蛋白磷酸化，最终介导细胞死亡［1］。基于上述主要理论，我们设计并在原核系统中成功的表达了重组蛋白p75NTR169－Fc，期望其类似p75NTR游离受体的活性能够结合Aβ并抵抗其毒性作用，为AD治疗开辟新途径。

重组人抗酶裂嵌合体蛋白p75NTR169－Fc保留了p75NTR完整的胞外区和茎部9个氨基酸，去掉了易受蛋白酶攻击的部分，使其不再被蛋白酶降解而提高了重组蛋白的稳定性，我们之前表达的重组蛋白p75NTR194－Fc稳定性差，极易被蛋白酶降解［16］;在p75NTR169－Fc羧基端融合了IgG的Fc段，方便了蛋白纯化。在重组DNA设计时，通过合理使用质粒本身的酶切位点，目的蛋白不带有任何标签。经凝胶扫描纯度分析显示终产品纯度可达96%，为研究其活性提供了保证。此外Fc段蛋白的融合也为延长重组蛋白的半衰期提供了可能性。

Aβ(25～35)保留了Aβ全长的毒性，常用于Aβ的毒性研究。我们通过MTT法研究Aβ(25～35)对p75NTR阳性的PC12的细胞毒作用，表明10μmol/L、5μmol/L Aβ(25～35)作用24h可以明显杀伤 PC12细胞。而重组蛋白p75NTR169－Fc可以有效地抑制Aβ(25～35)引起的细胞毒性。有趣的是，在本研究中，重组蛋白p75NTR169－Fc的浓度600nmol/L比5μmol/L Aβ(25～35)低近10倍的情况下，仍可有效地与p75NTR竞争，可能与该重组蛋白氨基端的p75NTR的胞外区(ECD)对Aβ的高亲和力结合有关。

为了更好地研究重组蛋白p75NTR169－Fc与配基结合的生物学活性，我们通过PC12细胞轴突生长实验，发现重组蛋白可以抑制NGF引起的轴突生长。根据文献报道，p75NTR与trkA受体介导NGF引起的轴突生长和突触连接［2］。在我们的实验中，50ng/ml的NGF刺激PC12细胞轴突生长;同时加入NGF与NGF抗体或者重组蛋白p75NTR169－Fc，与只加NGF相比，神经轴突明显变短、数量变少，随着NGF抗体或者重组蛋白p75NTR169－Fc剂量的增加，抑制轴突生长的程度更加明显。毋庸置疑，NGF抗体是通过竞争游离的NGF，而减少NGF与受体相互作用的机会，而重组蛋白p75NTR169－Fc保留了和配体结合的胞外结构域，理论上讲，其可以和NGF结合，但由于其不含传递细胞外信号的跨膜区和胞内结构域，所以重组蛋白p75NTR169－Fc和p75NTR竞争结合 NGF，而不能发挥刺激轴突生长的功能。proNGF是NGF未经蛋白酶切割的前体，也是NGF在AD中存在的主要形式。有研究表明，proNGF通过p75NTR抑制神经轴突的生长。p75NTR169－Fc作为新型重组蛋白，与p75NTR竞争结合配体，有望在AD的治疗中，除了结合Aβ也能结合proNGF而发挥一箭双雕的作用。

针对p75NTR为药物靶点的研究，不少研究者做了很多的工作，如Yaar M等合成的NGFβ发夹环类似物可以和Aβ竞争结合p75NTR，从而保护神经元免受Aβ介导的毒性作用，而我们构建的重组蛋白p75NTR169－Fc与p75NTR竞争结合Aβ，同样是为了保护神经元免受Aβ的毒性作用。尽管该工作还有待更深一步的研究，但重组人抗酶裂嵌合体蛋白p75NTR169－Fc是一个有生物活性的新型抗凋亡蛋白，有可能为阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗开辟了又一途径。

1 Roux PP，Barker PA．Neurotrophin signaling through the p75 neurotrophin receptor［J］．Prog Neurobiol，2002，67(3):203 － 233

2 Schor NF．The p75 neurotrophin receptor in human development and disease［J］．Prog Neurobiol，2005，77(3):201 －214

3 Chao MV．The p75 neurotrophin receptor［J］．JNeurobiol，1994，25(11):1373－1385

4 Nykjaer A，Lee R，Teng KK，et al．Sortilin is essential for proNGF－induced neuronal cell death［J］．Nature，2004，427(6977):843 －848

5 Sotthibundhu A，Sykes AM，Fox B，et al．Beta－amyloid(1－42)induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor［J］．J Neurosci，2008，28(15):3941 － 3946

6 Costantini C，Rossi F，Formaggio E，et al．Characterization of the signaling pathway downstream p75 neurotrophin receptor involved in beta－amyloid peptide － dependent cell death［J］．J Mol Neurosci，2005，25(2):141－156

7 Yaar M，Zhai S，Pilch PF，et al．Binding of beta－amyloid to the p75 neurotrophin receptor induces apoptosis．A possible mechanism for Alzheimer's disease［J］．JClin Invest，1997，100(9):2333 －2340

8 Wu CK，Thal L，Pizzo D，et al．Apoptotic signals within the basal forebrain cholinergic neurons in Alzheimer's disease［J］．Exp Neurol，2005，195(2):484－496

9 Coulson EJ，Reid K，Baca M，et al．The role of neurotransmission and the Chopper domain in p75 neurotrophin receptor death signaling［J］．Prog Brain Res，2004，146:41 －62

10 Coulson EJ，Reid K，Baca M，et al．Chopper，a new death domain of the p75 neurotrophin receptor that mediates rapid neuronal cell death［J］．J Biol Chem，2000，275(39):30537－30545

11 Welcher AA，Bitler CM，Radeke MJ，et al．Nerve growth factor binding domain of the nerve growth factor receptor［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(1):159 －163

12 Zampieri N，Xu CF，Neubert TA，et al．Cleavage of p75 neurotrophin receptor by alpha－secretase and gamma－secretase requires specific receptor domains［J］．J Biol Chem，2005，280(15):14563 －14571

13 Dickson DW．Apoptotic mechanisms in Alzheimer neurofibrillary degeneration:cause or effect?［J］．J Clin Invest，2004，114(1):23 －27

14 Pike CJ，Walencewicz AJ，Glabe CG，et al．In vitro aging of beta －amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity［J］．Brain Res，1991，563(1 －2):311 －314

15 Roger N，Rosenberg MD．Translational research on the way to effective therapy for Alzheimer disease［J］．Arch Gen Psychiatry，2005，62(11):1186－1192

16 周素芳，王欣，陈虹，等．p75NTR－Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达、鉴定和活性分析［J］．中国生物化学与分子生物学报，2004，20(5):604－609