ACE2通过下调AT1R和ERK1/2的磷酸化而抑制平滑肌细胞的增殖

曹金龙，龚晶婧，许昌声，王华军，卢卓强，晋学庆

(福建医科大学附属第一医院心内科，福建省高血压研究所，福建福州 350005)

肾素－血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是一个复杂的体液调节系统，它与心血管疾病如高血压病、动脉粥样硬化等疾病的发生密切相关［1］。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)在RAS系统中发挥着重要的病理生理学作用，AngⅡ可以通过其特异的血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R)及其下游信号分子实现多种生物学作用，如AngⅡ可以通过细胞外基质激 酶 (Extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)信号通路介导平滑肌细胞增殖、迁移等［2］，血管平滑肌细胞的增殖会导致血管壁增生肥厚，是高血压病、动脉粥样硬化等心血管疾病的病理基础。自从2000年Donoghue等［3］研究发现一种与血管紧张素转换酶(ACE)是同源物质的血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme，ACE2)以后，这为RAS研究开辟一个新领域。ACE2与ACE的不同在于它是一种单羧基肽酶，可以水解AngⅡ生成Ang(1-7)，研究发现Ang(1-7)可以对抗AngⅡ介导的多种生物学作用［4］。虽然过去的研究发现ACE2可以作为一种重要的负向调节因子对抗AngⅡ介导的的多种心血管疾病的发生。然而，关于ACE2发挥作用的具体机制目前仍然不是十分清楚，本研究利用载有ACE2基因的慢病毒表达载体感染SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞，研究ACE2的过表达对AT1R表达的影响，观察 ACE2过表达对ERK1/2磷酸化水平的变化以及平滑肌细胞增殖的影响，以期进一步阐明ACE2对平滑肌细胞增殖影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 SD成年大鼠(120～150 g)(福建医科大学实验动物中心)♀♂不限，慢病毒表达载体(Lentiviral-ACE2))和空载体慢病毒(Lentiviral-GFP)由上海Genechem基因技术公司协作构建和扩增;AngⅡ购自(美国，Sigma公司)，ACE2兔抗大鼠一抗、AT1R兔抗大鼠一抗购自(美国Abcam公司)、ERK1/2和p-ERK1/2兔抗大鼠一抗购自(美国CST公司)、β-actin小鼠抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗购自(美国Santa Cruz公司)，磷酸酶抑制剂Cocktail购自(美国 Invitrogen公司)，DMEM培养基、胎牛血清购自(美国Gibco公司)，RIPA细胞裂解液(RIPA Lysis Buffer)，蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)，Cell Counting Kit-8(CCK-8 Kit)试剂购自(碧云天生物技术有限公司)。

1.2 平滑肌细胞的培养与实验分组 SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的培养，采用组织贴块法进行平滑肌细胞原代以及传代培养，免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞［5］。选用培养至第3代的平滑肌细胞，使用含体积分数为0.1胎牛血清的完全培养液以5×104细胞/孔接种于6孔培养板。在37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，待细胞生长融合至孔底面积的0.5～0.6时，慢病毒以感染复数MOI为10感染平滑肌细胞不同时间并分组为:对照组、空载体组、感染24、48、72和96 h组;待细胞长满6孔板底面积的0.80 时，AngⅡ以 10－7mol·L－1浓度分别孵育不同时间并分组为:对照组、3、6、9、12 和 15h 组;慢病毒感染平滑肌细胞96 h后，继续加入AngⅡ孵育12 h后提取总蛋白，并分各干预组为:对照组、Lentiviral-GFP、AngⅡ、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2和Lentiviral-ACE2组;同样慢病毒感染平滑肌细胞96 h后，相继加入AngⅡ孵育5 min后提取总蛋白，并将各干预组分组为:对照组、AngⅡ、Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2和Lentiviral-ACE2组。

1.3 荧光显微镜观察慢病毒绿色荧光蛋白表达细胞接种同上，将慢病毒(Lentiviral-GFP)以感染复数为10(multiplicity of infection，MOI=10)感染平滑肌细胞，感染12 h后换成新鲜的的完全培养液，共计培养96 h后，在荧光显微镜(放大倍数为×100)下观察慢病毒绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达情况。

1.4 细胞增殖的测定 采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测平滑肌细胞增殖，利用细胞线粒体中的脱氢酶还原性与底物显色可间接反映细胞数目。选用第3代平滑肌细胞，使用含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，用含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液配成细胞悬液，光镜下计数，以5×103细胞/孔接种于96孔板中且每孔体积定容为100 μl，并将各干预组分组为:对照组、Lentiviral-GFP、AngⅡ、AngⅡ +Lentiviral-GFP、AngⅡ +Lentiviral-ACE2 和Lentiviral-ACE2组，每组设5个复孔，并设置空白背景组。以MOI=10将慢病毒感染细胞96 h后，随后加入 AngⅡ(10－7mol·L－1)干预 24 h，然后每孔内加入 CCK-8 增殖反应液 10 μl，在 37℃、5%CO2培养箱内孵育1.5 h，在酶标仪上450 nm处检测其吸光度。

1.5 Western blot 采用常规Western blot法检测ACE2、AT1R蛋白以及ERK1/2的磷酸化水平，待各组完成干预后，吸掉培养液，在6孔板内各孔加2 ml 4℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS 0.01 mol·L－1pH 7.4)或TBS缓冲液，重复以上操作两次，共洗细胞3次以洗去培养液。在各孔加入200 μl RIPA细胞裂解液(RIPA Lysis Buffer)(1 ml RIPA裂解液加10 μl PMSF(100 mmol·L－1)和 10 μl Cocktail磷酸酶抑制剂)，待细胞充分裂解后，提取总蛋白，采用BCA法对总蛋白进行定量，取30 μg总蛋白进样于预灌制的7.5%聚丙烯酰胺凝胶中，电压100 V、SDSPAGE电泳2 h，按1～2 mA·cm－2电流转膜1.5 h将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，ACE2一抗(1 ∶1 000)、AT1R 一抗(1 ∶1 000)、ERK1/2和pERK1/2一抗(1∶2 000)、β-actin一抗(1∶2 000)4℃过夜、用含(1∶1 000)吐温的Tris缓冲液(TBST，pH=7.4)洗膜3×10 min、然后在山羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h、TBST洗膜3×10 min，最后加入ECL发光剂、曝光、显影和定影，采用Image J(1.44)软件对特异性条带进行半定量分析。

1.6 统计学方法 应用SPSS11.5软件进行统计学分析，计量数据用±s表示，两组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 慢病毒感染平滑肌细胞后目的蛋白的表达

如Fig 1所示，A图是可见光视野，B图为绿色荧光视野，荧光显微镜下可见细胞核以及细胞质，两图均可见绿色荧光蛋白。提示慢病毒表达载体能够高效表达目的蛋白质。如Fig 2所示，慢病毒感染平滑肌细胞不同时间后，ACE2蛋白的表达量呈时间依赖性增加，慢病毒感染平滑肌细胞24 h后ACE2蛋白的表达量开始增加，慢病毒感染细胞96 h ACE2蛋白表达量较对照和空载体比较均有明显增加(1.23±0.06vs0.54±0.03和0.54±0.09，P＜0.05)，说明载有ACE2的慢病毒随时间依赖性高效表达ACE2蛋白。

2.2 ACE2过表达对平滑肌细胞增殖的影响 如Fig 3所示，AngⅡ可以明显促进平滑肌细胞的增殖(0.68±0.03vs0.40±0.02，P＜0.05)。ACE2过表达后明显抑制AngⅡ诱导的细胞增殖作用与单用AngⅡ组比较(0.53±0.102vs0.68±0.03，P＜0.05)，同时发现单用Lentiviral-ACE2感染平滑肌细胞后有抑制平滑肌细胞增殖作用(0.26±0.06vs0.40±0.02，P＜0.05)。提示无论在有或无 AngⅡ孵育情况下ACE2均具有抑制平滑肌细胞增殖的作用。

Fig 1 Effect of lentiviral-GFP transfection on vascular smooth muscle cells(MOI=10)

Fig 2 ACE2 protein expression after gene transfection in vascular smooth muscle cells(n=4)

Fig 3 Effects of ACE2 gene transfection on VSMCs proliferation(n=4)

2.3 ACE2过表达对AT1R表达的影响 如Fig 4所示，AngⅡ(10－7mol·L－1)孵育平滑肌细胞不同时间后AT1R成时间依赖性上调，并且AngⅡ在作用12 h较对照组比较AT1R开始明显升高(0.24±0.01vs0.12±0.01，P＜0.05)。如 Fig 5所示，ACE2对AngⅡ诱导的AT1R的上调与单用AngⅡ组比较有明显抑制作用(0.34±0.07vs0.72±0.07，P＜0.05)，同时发现单用ACE2慢病毒感染平滑肌细胞较无AngⅡ干预组比较也具有下调AT1R作用，提示无论在有或无AngⅡ作用下，ACE2均可以下调AT1R。

Fig 4 Effects of angiotensinⅡon AT1R expression in vascular smooth muscle cells(n=4)

Fig 5 Effects of ACE2 overexpression on AT1R expression in vascular smooth muscle cells(n=4)

2.4 ACE2蛋白过表达对ERK1/2的磷酸化水平的影响 如Fig 6所示，AngⅡ孵育平滑肌细胞后ERK1/2的磷酸化水平明显升高。空载体慢病毒对AngⅡ诱导ERK1/2的磷酸化水平与单用AngⅡ组比较差异无显著性，但ACE2过表达对AngⅡ诱导的ERK1/2的磷酸化水平较单用AngⅡ组比较有明显抑制作用(0.43±0.06vs0.71±0.08，P＜0.05)，同时载有ACE2基因的慢病毒感染平滑肌后有抑制ERK1/2的磷酸化(0.28±0.06vs0.39±0.04，P＜0.05)，提示ACE2过表达可以抑制ERK1/2的磷酸化水平。

*P＜0.05 vs control and GFP;#P＜0.05 vs AngⅡ and AngⅡ +GFP

3 讨论

本研究发现，ACE2蛋白过表达明显抑制平滑肌细胞的增殖并且具有下调AT1R以及抑制其下游信号分子ERK1/2的磷酸化水平，提示ACE2抑制平滑肌细胞增殖可能是通过抑制AT1R的上调和ERK1/2的磷酸化水平而实现的。

Gurley等［6］的研究发现在ACE2基因敲除的小鼠模型研究中，ACE2缺陷的小鼠心血管功能发生严重紊乱，提示ACE2在心血管系统中发挥有重要作用。国内有研究报道，ACE2的升高可以改善心肌重塑［7］并且具有血管保护作用［8］，这些现象提示我们，研究ACE2在心血管系统中所发挥作用的具体机制，对于我们深入的了解肾素血管紧张素系统在心血管疾病中的作用以及指导心血管疾病的临床治疗具有重大意义。然而，国内外对于ACE2抑制平滑肌细胞增殖及其相关机制鲜有报道。本研究使用载有ACE2基因的慢病毒表达载体感染平滑肌细胞，观察ACE2过表达对平滑肌细胞增殖的影响，进一步研究ACE2对AT1R的表达以及信号分子ERK1/2磷酸化影响，探讨ACE2对平滑肌细胞增殖影响的可能机制。

首先，本研究进一步证实AngⅡ具有促进平滑肌细胞增殖的作用，这一结果与之前的研究结果相一致，如Dzau等［9］研究表明AngⅡ可以通过AT1R介导促细胞增殖等多种生物学作用。另外发现ACE2蛋白过表达明显抑制AngⅡ诱导的平滑肌细胞增殖，同时还发现平滑肌细胞在无外源性AngⅡ刺激下，ACE2也具有抑制平滑肌细胞增殖效应，这一结果目前国内外少有相关报道。Ferrario等［10］研究表明ACE2发挥生物学作用主要是通过水解AngⅡ生成Ang(1-7)，Ang(1-7)通过MAS受体发挥抑制细胞增殖、降血压、抗炎和抗氧化应激等作用。具体机制目前主要认为一方面可能是Ang(1-7)促进缓激肽的增加或者是直接通过AT2R受体而发挥抑制细胞增殖等生物学作用，另一方面，如Deddish等［11］研究发现Ang(1-7)可以直接通过抑制ACE而发挥对抗AngⅡ介导的生物学作用。然而，我们研究发现ACE2过表达具有下调AT1R的作用，这与Zhang等［12］研究结果是一致的，这一发现提示ACE2抑制平滑肌增殖有可能是通过下调AT1R而实现的。

其次，Santos等［13］研究表明 AngⅡ可以通过AT1R及其下游多种信号分子如 Rac 1、JNK、p38MAPK等介导细胞增殖、血管收缩、增加氧化应激等病理生理作用。本研究发现ACE2过表达后对ERK1/2的磷酸化有明显抑制作用。已有的研究表明ACE2作用主要是通过降解AngⅡ生成Ang(1-7)而发挥生物学作用，如Su1等［14］研究发现，Ang(1-7)能够抑制AngⅡ诱导的近端小管细胞的MAPK磷酸化水平，且这种抑制作用能被Ang(1-7)的特异性受D-Ala7-Ang(1-7)所阻断，提示Ang(1-7)可能是通过MAS受体抑制了ERK1/2的磷酸化。然而，我们发现ACE2过表达后明显抑制平滑肌细胞AT1R蛋白表达以及其下游信号通路ERK1/2的磷酸化，这与Zhong等［15］研究结果一致，但其具体分子机制有待于我们更进一步研究。

总之，本研究发现 ACE2可以通过对AT1RERK1/2通路的影响而抑制平滑肌细胞的增殖从而发挥血管保护的作用，血管平滑肌细胞的增殖与高血压、动脉粥样硬化和PCI术后血管再狭窄等多种心血管疾病的发生密切相关，对于心血管疾病的临床治疗具有重要意义。对于ACE2在心血管疾病中所发挥具体作用的分子机制的研究，为其今后可能在心血管疾病治疗中的临床应用提供理论依据。

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