聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子注射液Ⅰ期临床药代动力学和药效学研究

韩晓红，张春玲，刘 鹏，宋媛媛，姚嘉瑞，秦 燕，唐 乐，张淑香，李 丹，冯 云，石远凯

(北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所内科，北京 100021)

化疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一，但化疗药物造成的不良反应如骨髓抑制等不仅给患者增加了感染、出血等风险，同时还直接影响了化疗的顺利进行。

重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)是一种防治肿瘤化放疗引起的中性粒细胞减少症的有效药物，它与表达在中性粒细胞及其祖细胞表面的高亲和性、特异性受体结合，促进粒细胞系的造血干细胞的分化和增殖，促进骨髓中成熟的中性粒细胞向外周血释放，同时刺激造血干细胞向外周血释放［1］。但因rhG-CSF易被酶水解和肾脏清除，在体内半衰期短，需每日给药，重复注射不仅增加了患者的痛苦，也会引起一些不良反应。目前，为了解决这些问题，降低酶解机会，增加稳定性，延长血浆消除半衰期，减小血药浓度波动，许多药品研究机构进行了大量长效rhG-CSF制剂的研究，部分制剂已上市，如美国Amgen公司生产的PEG-rhG-CSF(商品名Neulasta)。

北京双鹭药业股份有限公司研发的PEG-rhGCSF制剂，通过基因重组技术在大肠埃希菌表达并纯化rhG-CSF，以分子质量为20 ku的PEG共价修饰后制成制剂。经国家食品药品监督管理局批准(临床研究批件号:2009L01505)，在中国医学科学院肿瘤医院开展Ⅰ期临床研究。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器 聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子注射液(PEG-rhG-CSF，规格:1.0 g·L－1/支，批号:20090401，由北京双鹭药业股份有限公司研制)，重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF，规格:150 mg·L－1/支，北京双鹭药业股份有限公司生产)。Human G-CSF ELISA试剂盒，美国R＆D Systems。超纯水处理系统(型号:MILLIQ)，美国密理博公司;酶标仪(型号:680型)，美国伯乐公司;血细胞分析仪(型号:XT-1800i)，日本希森美康;流式细胞仪(型号:FACSCalibur)，美国BD公司;全自动生化分析仪(型号:Modular P-800)，瑞士罗氏公司。

1.2 受试患者入选标准 经病理组织学或细胞学确诊的肿瘤患者;KPS评分≥60，年龄18～75岁，男女不限，预计生存期3个月以上;既往未接受过放疗、化疗;骨髓造血功能正常(骨髓穿刺细胞学检查示骨髓增生活跃，且未见恶性肿瘤细胞浸润);外周血常规正常，无出血倾向;无明显心功能障碍或代谢性疾病，肝功能指标AST、ALT、总胆红素均在正常上限的2.5倍以内，肌酐、尿素氮均在正常上限的1.5～2倍以内，自愿受试并签署知情同意书;能遵守试验用药及血液样品采集规程。

临床试验方案、临床病例报告表、知情同意书等均取得中国医学科学院肿瘤医院GCP中心伦理委员会审批并备案。

1.3 受试者一般情况 入组受试患者共24例，其中14例男性，10例女性，中位年龄为57岁(34岁～69岁)，23例非小细胞肺癌患者，1例鼻咽癌患者(Tab 1)。

Tab 1Patient characteristics by dosage group(±s，n=8)

Tab 1Patient characteristics by dosage group(±s，n=8)

Characteristic Group 60 μg·kg－1100 μg·kg－1150 μg·kg －1 Sex Male 5 5 4 Female 3 3 4 Age(years)Mean 54.3 52.8 59.1 Median 57.5 52.5 58 SD 7.1 9.9 4.5 Range 41～62 34～69 53～67 Baseline ANC(×109cells·L－1)Mean 5.66 4.75 5.30 Median 5.55 4.76 5.20 SD 1.5 1.4 1.7 Range 3.69 ～8.1 2.69 ～7.36 2.95 ～8.01 Cancer type Non-small cell lung cancer 7 8 8 Nasopharyngeal cancer 1 0 0

1.4 试验设计 本研究为单中心、开放性剂量递增的Ⅰ期临床试验，受试患者均采用以卡铂和紫杉醇为基础的2个周期化疗方案，用药剂量分别为紫杉醇175 mg/m2，化疗周期 d 1静脉输注3 h，卡铂AUC 5化疗周期d 1静脉输注30 min，21 d为一周期，两个化疗周期用药剂量和时间相同。

第1周期化疗时不用PEG-rhG-CSF或其它升白细胞药物，但当 ANC＜0.5×109cells·L－1或ANC ＜1.0×109cells·L－1且伴有发热时，每日1次皮下注射rhG-CSF 150 μg，至连续2次外周血白细胞数(WBC)≥10×109cells·L－1或 ANC≥5.0×109cells·L－1时停止给药。

第2周期在化疗药物给药结束后48 h皮下注射PEG-rhG-CSF 1次，参照费氏递增法，递增剂量分别为60、100、150 μg·kg－13 个剂量组(每一剂量组受试患者8例，同一受试患者不进行重复试验，从小剂量开始，每个剂量观察结束后，才可进行下一剂量。不可同时进行2个以上剂量组的试验。如出现重度不良反应或半数以上受试者出现中度不良反应，即使未达到最大剂量，均停止试验)。

1.5 样本采集

1.5.1 PEG-rhG-CSF血药浓度监测 分别于PEG-rhG-CSF 给药前 3 0 min(0 h)、给药后2、4、8、12、16、24、36、48、72、96、144、216、288、360、432 h 于静脉采血并分离血清，于－80℃冰箱保存，备测。

1.5.2 血常规及CD34+检查 血细胞分析仪测定血常规，流式细胞仪检测CD34+细胞，第一周期化疗期间从化疗d 2起隔日检查血常规，直到化疗周期的d 20结束。第2周期化疗期间从化疗d 2起每日定时检查血常规(含ANC)及CD34+细胞，至d 14(其中d 3注射PEG-rhG-CSF后12 h加测一次血常规及CD34+细胞)，以后隔日检查一次直到化疗周期的d 20结束。

1.5.3 血清生化指标检查 两个化疗周期的给药前、化疗周期中d 8、15利用全自动生化分析仪分别检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、血糖、尿素氮、血清肌酐、β2微球蛋白等血清生化指标。

1.6 血药浓度测定 使用Human G-CSF检测试剂盒，按试剂盒说明书操作步骤，进行血清中rhG-CSF浓度检测。

1.7 数据处理及分析 用Microcal origin 8.0软件以四参数方程拟合标准曲线，WinNonlin 5.2.1软件进行药代动力学参数分析，并计算AUC0-t、CL_F等参数，Excel for Windows(2007版，微软公司)进行数据处理，实验结果数据以±s表示，利用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 方法学研究 本方法的准确度和精密度良好，均符合生物样品的测定要求，用试剂盒定量检测血清中的 P EG-rhG-CSF浓度，经试验验证，在39～2 500 ng·L－1范围内，呈现良好的线性。标准曲线用四参数方程进行拟合，相关系数均大于0.99。本试验最低定量限为标准曲线的最低浓度，即39 ng·L－1。方法学考察结果显示，日内精密度(RSD%)为4.3% ～6.8%，日间精密度(RSD%)为 4 .7% ～13.3%，准确度(RE%)为 －5.0% ～2.7% 。同时验证了血清样本在室温放置2 h及－20℃放置8周稳定性均良好。血清样品的稀释因子范围为5～300。用6个健康人的空白血清配制与质控样品相同浓度的高、中、低3个浓度样品，每个浓度进行3个平行样品考察是否存在基质效应，结果显示低浓度点 RE%小于20%，中、高浓度点 RE%均小于15%。另外该试剂盒与IL-2、IL-3、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子均无明显交叉反应。

2.2 血药物浓度测定结果 测定各剂量组不同采血时间点血清中药物浓度，绘制平均血药浓度－时间曲线(Fig 1)。

Fig 1 The concentration-time curve of subjects after injecting different doses of PEG-rhG-CSF(±s)

2.3 药代动力学研究 药代动力学研究结果(Tab 2)，将3个剂量组间Tmax、T12进行比较，低、中剂量组差异不具有统计学意义(P＞0.05)，低、中剂量组与高剂量间差异均具有统计学意义(P＜0.05)。提示给药剂量 ＜ 100 μg·kg－1，吸收速率和半衰期并未受到给药剂量的影响，但当给药剂量 ＞ 100 μg·kg－1，可能是由于给药部位及体内的受体达到局部饱和状态，导致吸收速率和半衰期延长。3个剂量组间Vz_F差异较小(0.935～0.821 ml·g－1)(P＞0.05)，提示表观分布容积并未受给药剂量影响;3个剂量组间 A UC0-t，Cmax，CL_F 比较，低、中、高剂量差异均具有统计学意义(P＜0.05)，随着给药剂量的增加，AUC0-t增加，Cmax增加，CL_F 降低，提示药物在体内存在一定的蓄积，在当前给药剂量范围内，PEG-rhG-CSF在体内呈现非线性的药代动力学特征。

2.4 药效学研究

2.4.1 两个周期中ANC动态变化 rhG-CSF是防治肿瘤化放疗引起的中性粒细胞减少症的有效药物，通过检测患者外周血中性粒细胞绝对计数(ANC)可以初步判断其疗效。观察各剂量组第1周期ANC变化(Fig 2)，第1周期3个剂量组ANC第1峰值均值分别为(9.0±5)、(12.7±3)、(5.8±1)×109cells·L－1，ANC 最 低点均值分别为(1.0 ±1)、(0.7 ±0.1)、(1 ±1)×109cells·L－1，最低点时间为13、11、15 d，在60 μg·kg－1剂量组有3 位患者在化疗过程中出现Ⅳ度骨髓抑制，注射了rhG-CSF，故ANC呈现双峰变化。

Tab 2Pharmacokinetic parameters of PEG-rhG-CSF(±s)

Tab 2Pharmacokinetic parameters of PEG-rhG-CSF(±s)

Parameter Group 60 μg·kg－1 100 μg·kg－1150 μg·kg －1 T 12/h 37.5 ±7 40.8 ±12 80.7 ±48 Tmax/h 16±10 23±7 33±8 Cmax/mg·L－1 112.41 ±61 199.49 ±75 371.5 ±145 AUC0-t/mg·h·L －1 5，593.6 ±5，435 14，651.3±12，183 23，002.5 ±6，655 Vz_F/ml·g－1 0.935 ±0.634 0.576 ±0.327 0.821 ±0.576 CL_F/μl·h－1·g－117±9 9±4 7±2

Fig 2 The contrast of ANC among different drug dose groups in the 1st chemotherapy cycle(±s)

各剂量组第2周ANC均呈现双峰变化(Fig 3)，3个剂量组ANC第1峰值分别为(35.0±10)、(25.2±5)、(27.4 ±11)×109cells·L－1，3 个剂量组的ANC均值最低点依次为(1.9±1)、(2.3±2)、(6.6 ±5)×109cells·L－1，最低点时间点为 7、7、2 d，第2峰值分别为(7.8±3)、(11.0±3)、(16.7±9)×109cells·L－1。随着给药剂量的提高，ANC最低值、第2峰的峰值均有增高趋势，各剂量组的ANC的变化与PEG-rhG-CSF呈现一定程度的量效关系。

对比第1周期和第2周期的ANC平均值，第2周期的第1峰值、最低值均高于第1周期，ANC最低值出现时间前移。

2.4.2 药代动力学和药效学联合分析 第2周期各剂量组ANC与血药浓度的动态变化拟合图显示(Fig 4)，以100 μg·kg－1为例，该剂量组 ANC 在化疗周期的d3起开始下降，到d7降到最低点，期间PEG-rhG-CSF于d 3达到峰值，随后开始缓慢下降;在d 7～10之间ANC持续上升，d 10达第2峰，此后ANC数值维持在一个较高的水平，此时PEG-rhG-CSF的血药浓度开始迅速下降。血药浓度变化与ANC值呈现相关性，且药效峰值的出现时间滞后于血药浓度峰值出现的时间，药物的效应与血药浓度存在一定的滞后性。

Fig 3 The contrast of ANC among different drug dose groups in the 2nd chemotherapy cycle(±s)

Fig 4 The relationship of ANC and serum drug concentration among different drug dose groups(±s)

2.4.3 外周血CD34+细胞数量的变化 应激、内毒素、剧烈运动、化疗和细胞因子(G-CSF、GM-CSF等)可明显增加外周血中造血干细胞数，目前以细胞因子(G-CSF、GM-CSF)动员居多，同时动态检测动员后外周血中CD34+细胞的含量可确定采集最佳时机。本实验通过观察PEG-rhG-CSF对外周CD34+细胞数量的影响，观察其对造血干细胞的动员作用(Fig 5)，在第2周期化疗中，发现3个剂量组的平均CD34+细胞达峰中位时间为d 9(9～10 d)，峰值分别为(19.7±14.2)、(30.8±15.0)和(27.6±21.2)×106cells·L－1，3 个剂量组 CD34+细胞均增高，但从变化趋势来看，组间的量效关系并不明显。

Fig 5 The cell numbers of peripheral blood CD34+cell among different drug dose groups(±s)

2.4.4 两个周期血清生化指标的变化 观察PEG-rhG-CSF的使用是否对生化指标有影响。根据检测结果，进行数据统计学分析，比较不同剂量组在化疗的不同时间，差异均没有统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

rhG-CSF目前已广泛应用于临床治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症［2－3］，同时还用于造血干细胞移植的干细胞动员与移植后造血功能重建等。但rhG-CSF半衰期短，需要频繁给药，易引起不良反应，增加了患者的痛苦。PEG化的rhG-CSF分子量增大，稳定性提高，清除率减慢，半衰期延长，作用更为持久，减少了给药次数，减轻了患者的痛苦。

rhG-CSF在体内可以通过肾脏和中性粒细胞介导的两种途径清除，但PEG-rhG-CSF分子量增大，肾小球滤过减少，中性粒细胞介导清除占主导地位［4－9］。当ANC降低时，中性粒细胞介导清除过程减缓，药物在体内蓄积，PEG-rhG-CSF血药浓度开始上升，使ANC增高;而当ANC增高时，中性粒细胞介导清除过程加快，血药浓度迅速下降，ANC值维持在基线水平之上。这种自我调节大大提高了PEG-rhG-CSF在使用上的安全性。

本研究中PEG-rhG-CSF在低剂量组的平均半衰期为 37.5 h，平均清除率为 17 μl·h－1·g－1，与文献报道的rhG-CSF半衰期3.37～3.5 h，清除率30 ～ 39.6 μl·h－1·g－1［6，8］相比，PEG-rhG-CSF 的半衰期明显延长，清除速率明显减慢。同时发现在第1周期化疗过程中，受试患者均在不同程度上出现了骨髓抑制现象，其中60 μg·kg－1剂量组有3位患者在化疗过程中出现Ⅳ度骨髓抑制，在第2周期给予受试药物后，无1例病人出现骨髓抑制现象，且ANC最低值出现时间前移，ANC最低值提高，1次注射后无重复注射，同时该PEG-rhG-CSF(100 μg·kg－1)单次注射疗效与 filgrastim(5 μg·kg－1·d－1)多次给药的疗效［5］相当。本研究表明PEG-rhG-CSF的使用维持药效时间长、减少患者给药次数、降低化疗后出现Ⅳ度骨髓抑制的发生率。结合血药浓度、ANC变化及临床治疗需要，本研究确定100 μg·kg－1为Ⅱ期临床研究的推荐剂量。

与其他PEG化的制剂相比较，本研究的100 μg·kg－1剂量组消除相半衰期为40.8 h、平均清除率为 9 μl·h－1·g－1，而国外临床研究中 PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1剂量组的清除半衰期为 40.7 h，平均清除率为 12.3 μl·h－1·g－1［7］，本实验 PEG-rhG-CSF半衰期稍有延长，清除率降低明显。同时还发现，本研究中给予PEG-rhG-CSF后，随着给药剂量的提高，ANC最低值、第2峰的峰值均有增高趋势，各剂量组ANC的变化与PEG-rhG-CSF呈现一定程度的量效关系，但在国外临床研究中［7］，ANC的变化与PEG-rhG-CSF并没有量效关系，这可能是由于本研究中患者既往未接受过放、化疗，给予两个周期相同的化疗药物和化疗剂量，而国外临床研究的患者给予的化疗方案和化疗剂量各不相同，导致了治疗反应性的差异，影响了实验的结果。

另外，本研究考察了PEG-rhG-CSF用于肿瘤患者自体外周血干细胞动员的可行性，PEG-rhG-CSF对外周血CD34+细胞动员效果存在明显的个体差异，化疗后动员的 CD34+细胞以 100 μg·kg－1剂量组动员最高，150 μg·kg－1剂量组动员效果与国外研究中 300 μg·kg－1剂量组接近［6］，同时 PEG-rhGCSF与外周血干细胞动员不具有量效关系。因此PEG-rhG-CSF是否适用于肿瘤患者外周血干细胞动员及其最适剂量仍有待研究。

本研究还发现，PEG-rhG-CSF的效应与血药浓度存在一定的滞后现象，有研究报道，血液通常不是药物的直接作用部位，而直接靶标是效应部位，通常指受体、酶和细胞膜等特异性超微结构，所以大多数药物效应的变化滞后于血药浓度的变化［11－12］，基于这种变化已有研究者将PK/PD结合模型运用于PEG-rhG-CSF［13］和 rh-GSF［14］的研究，将剂量－浓度－效应关系进行估算，该模型能很好的反映药物与受体结合及药物从体内清除的过程，从而能够解释效应与血药浓度滞后的原因，因此PK/PD结合模型在Ⅰ期临床研究中的意义有待研究。在今后国内的临床研究中，我们应积极将PK/PD结合模型运用在药物临床研究方案中，加速药物开发进程。

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