灵芝多糖和当归多糖促进人外周血T淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ

耿卫朴，徐 曼，罗 祎，王婷婷，黄文炼，陈 瑜

(重庆医科大学1.病理教研室，分子与肿瘤研究中心，2.附属第一医院妇产科，重庆 400016)

手术、放疗和化疗是目前临床治疗恶性肿瘤的常规治疗方法，但放疗和化疗都有明显的毒副作用。灵芝和当归因无明显毒副作用，有一定的“生血”和增强患者机体抵抗力效果，故常用于肿瘤患者的辅助治疗［1］，但其作用机制尚不完全清楚。

灵芝多糖是灵芝(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)的水提取物中主要的活性成分，体内外实验证明它对抗原递呈细胞、单核巨噬细胞系统以及体液免疫和细胞免疫均有调节作用，尤其通过促进T细胞功能而增强实验小鼠机体的抗肿瘤效应［2-4］;文献报道灵芝多糖促进 ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖，还促进淋巴细胞的细胞因子基因转录和蛋白质合成，尤其是Th1类细胞因子IFN-γ和IL-12的表达。此外，灵芝多糖还有助于 γ射线损伤T细胞的修复［5］。当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是当归水溶性提取物。文献报道当归提取物能促进PI3K/ALT信号通路，该作用可能参与抑制小鼠外周血细胞的凋亡;此外，它还促进小鼠脾脏T细胞增殖、抑制移植性肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间［6-7］。因PI3K/Akt信号途径在T细胞增殖中发挥重要作用，而Caspase-3是细胞凋亡信号途径的效应分子，本研究采用免疫荧光染色、流式细胞术、MTT和ELISA方法观察了灵芝多糖和当归多糖对人外周血活化T细胞PI3K和Caspase-3蛋白表达及T细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 新鲜人外周血取自健康献血者;人淋巴细胞分离液为天津灏洋生物公司产品;尼龙毛为德国KISKER公司产品;RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品;小牛血清和胎牛血清为杭州四季青公司产品;灵芝多糖和当归多糖为陕西慈缘生物技术有限公司产品;PHA和MTT为美国Sigma公司产品;细胞增殖试剂盒为南京凯基生物公司产品;IFN-γ试剂盒为美国RD公司产品;鼠抗人PI3K和Caspase-3抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 超净工作台(苏州净化设备集团公司，苏州)，CO2细胞培养箱(SHEL-LAB公司，美国)，倒置相差显微镜(OLYMPUS公司，日本)，流式细胞仪(Beckman Coulter XL公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 健康人外周血T细胞的分离活化和培养新鲜抗凝外周血梯度离心后吸取单个核细胞，再经尼龙毛柱获得T淋巴细胞。将T淋巴细胞分为对照组、灵芝多糖组和当归多糖组，在含PHA(10 mg·L-1)的RPMI 1640(含10%胎牛血清)培养液中，37℃、5%CO2孵箱内培养，各组分别加入PBS、灵芝多糖(100 mg·L-1)和当归多糖(100 mg·L-1)培养1、2、24、72 h后进行后续实验。每组实验分别重复3次。

1.2.2 免疫荧光观察各组T细胞PI3K和Caspase-3蛋白表达 T淋巴细胞培养1、2和24 h后细胞涂片及10%甲醛固定后，分别加入鼠抗人PI3K抗体(1∶50)和Caspase-3抗体(1∶50)4℃冰箱孵育过夜，FITC标记抗鼠抗体(1∶50)37℃避光孵育1 h后，PBS清洗并用甘油封片，荧光显微镜观察。

1.2.3 MTT检测T细胞增殖 将对照组、灵芝多糖组和当归多糖组T细胞分别培养72 h并接种于96 孔板(每孔100 μl，细胞数1×108·L-1)，每组设3个复孔。每孔加入MTT溶液10 μl(5 g·L-1)培养4 h后，离心后吸去上清并加入二甲基亚砜(60 μl/孔)，低速震荡10 min，酶标仪490 nm测量各孔吸光度值(OD值)。

1.2.4 流式细胞术检测T细胞的细胞周期和凋亡率 收集上述各组培养72 h的T淋巴细胞，经体积分数为0.70的乙醇固定24 h后，流式细胞术检测T细胞的细胞周期和凋亡率。

1.2.5 ELISA检测T细胞培养上清液中IFN-γ含量 分别收集对照组、灵芝多糖组和当归多糖组T细胞培养72 h的上清液，按ELISA试剂盒说明书操作检测各组T淋巴细胞的IFN-γ含量。

1.2.6 图像分析和统计学方法 采用图像分析系统(Imagepro-Plus)对免疫荧光染色阳性强度进行分析。随机选5个高倍视野测量PI3K和Caspase-3的平均光密度，计算出平均值。采用SPSS 17.0软件计算各组数据的均数与标准差，实验结果以±s表示，t检验比较实验组与对照组间的差异。

2 结果

2.1 灵芝多糖和当归多糖对T细胞PI3K表达和T细胞增殖的影响 免疫荧光染色结果显示空白对照组、灵芝多糖组及当归多糖组T细胞培养1、2及24 h后细胞内均表达PI3K蛋白，但各组间平均光密度值无明显差别。MTT实验结果显示空白对照组、灵芝多糖组及当归多糖组T细胞增殖的OD值如表1，灵芝多糖组、当归多糖组与空白对照组间差异均有显著性(P＜0.01，P＜0.05)。

2.2 灵芝多糖和当归多糖对T细胞生长周期的影响 正常人外周血T细胞与灵芝多糖和当归多糖混合培养72 h后，各组细胞的G1、G2/M期及S期分布无差别。

2.3 灵芝多糖和当归多糖对Caspase-3蛋白表达及凋亡的影响 免疫荧光染色结果显示空白对照组和当归多糖组培养24 h后T细胞Caspase-3蛋白表达的平均光密度值分别为0.51±0.24和0.46±0.22，两组间差别无显著性;而灵芝多糖组T细胞Caspase-3蛋白表达的平均光密度值为0.38±0.16，明显低于空白对照组(P＜0.05)(Fig 1)。流式细胞术检测结果显示空白对照组和当归多糖组T细胞凋亡率分别为29.74%和29.87%，两组间差别无显著性;而灵芝多糖组T细胞凋亡率为18.23%，明显低于前两组。

Tab 1 Proliferation of T lymphocytes which were cultured 72 h(±s)

Tab 1 Proliferation of T lymphocytes which were cultured 72 h(±s)

t=16.955，＊＊P=0.003＜0.01 vs blank control;t=6.634，*P=0.022＜0.05 vs blank control

Group Blank control GLP ASP OD value 0.36±0.04 0.55±0.02＊＊ 0.52±0.02*

Fig 1 The expression of Caspase-3 of T lymphocytes

2.4 灵芝多糖和当归多糖对T细胞分泌IFN-γ的影响 ELISA检测结果显示T细胞培养72 h后，空白对照组上清液中IFN-γ含量为(1850.09±93.34)ng·L-1，灵芝多糖组和当归多糖组上清液中IFN-γ含量分别为(2071.41±166.40)ng·L-1和(2030.33±28.76)ng·L-1，均明显高于空白对照组(P＜0.05，P＜0.05)(Fig 2)。

Fig 2 IFN-γ concentration in supernatant of T lymphocytes

3 讨论

本实验观察到灵芝多糖和当归多糖均促进人外周血T细胞PI3K的表达，使T细胞增殖水平明显提高。PI3K在T细胞生存和增殖中的重要作用已得到研究者的证实，如 Hand等［8］发现无论记忆CD8+T还是效应CD8+T细胞都依赖于PI3K而生存，Soond等［9］发现PI3K不仅参与初始T细胞的分化，还与其分泌IFN-γ有密切关系。但本实验观察到空白对照组的T细胞也表达蛋白激酶PI3K，这可能与该组T细胞培养液内加入了具有刺激细胞增殖作用的PHA有关。Li等［10］还报道灵芝多糖可通过激活PKC和PKA激酶诱导小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞增殖并促进细胞免疫，提示PI3K可能只是灵芝多糖刺激T细胞增殖的信号途径之一。Liu等［11］报道当归多糖也通过PI3K途径促进小鼠造血干细胞增殖。当归多糖还能促进小鼠脾细胞增殖，并刺激免疫功能低下小鼠的CD4+T细胞增生。我们对照观察灵芝多糖、当归多糖与对照组T细胞的细胞周期情况，结果3组间并无明显差别，这可能与空白对照组培养液内的PHA作为有丝分裂原也促进T细胞的细胞周期运行，但灵芝多糖和当归多糖促进了更多的T细胞进入细胞周期有关。

本实验还观察到灵芝多糖和当归多糖均能降低人外周血活化T细胞Caspase-3的表达，尤其是灵芝多糖下调Caspase-3表达和抑制T细胞凋亡的作用明显。文献报道肿瘤患者外周血T细胞Caspase-3高表达与 T细胞凋亡有密切关系［12］。Liu等［11］报道当归多糖具有抑制小鼠造血干细胞凋亡的作用，但本实验未发现其有抑制人外周血T细胞凋亡的作用，推测当归多糖抗凋亡的作用可能在人和鼠之间存在差异。

本实验还观察到灵芝多糖和当归多糖均明显促进人外周血T细胞分泌IFN-γ。Gao等［13］证实灵芝多糖喂饲荷瘤小鼠明显抑制了肿瘤的生长，体外实验证实灵芝多糖不仅刺激了小鼠脾细胞的增殖，还促进了IFN-γ的分泌，T细胞的细胞毒作用也明显增强。灵芝多糖促进小鼠脾细胞增殖及分泌IFN-γ与细胞内GTP酶、磷脂酰肌醇转移蛋白等的活化，抑制凋亡相关蛋白如 CARD、β-actin，tubulin-α2，copine I和 γ-actin等活化有关［14］。我们推测本实验中灵芝多糖和当归多糖促进外周血T细胞分泌IFN-γ的作用可能与它们通过PI3K途径促进T细胞增殖，下调细胞凋亡相关蛋白Caspase-3从而抑制T细胞凋亡的作用密切相关。

本研究结果表明当归多糖和灵芝多糖具有促进人T细胞增殖和分泌IFN-γ的功能，灵芝多糖还具有抑制T细胞凋亡的作用。因此，灵芝多糖和当归多糖具有确切的促进人外周血T细胞免疫的作用。

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