胆碱能M受体信号通路在芍药苷抗脑缺血神经保护中的作用

王国峰，尹鲁平，赵 霞，陈冬梅

(1.济南军区总医院干部病房三科，山东 济南 250031;2.中国科学院生物物理所脑与认知科学中心，北京 100101)

脑卒中(stroke)是以局灶性神经功能缺失为共同特征，或伴发意识障碍的急性脑血管疾病。缺血性脑卒中(ischemic stroke)是最常见脑卒中类型，有关脑缺血病理机制的学说众多，如兴奋性氨基酸释放增多、细胞内钙超载、代谢性酸中毒等，但据此采取的治疗措施均不能获得理想疗效，尚缺乏有效的治疗药物。

芍药苷(paeoniflorn，PAE)是传统中药处方芍药根的主要成分，具有抗氧化、增强认知功能及内皮依赖性舒张血管等药理活性［1－3］。既往研究表明，PAE可通过激活腺苷Al受体，并抑制与之偶联的MAPK通路，阻断花生四烯酸通路炎症蛋白COX-2和5-LOX在脑缺血中过度表达，模拟缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)诱导药理预适应发挥延迟神经保护作用［4］。

本文在上述基础上进一步研究PAE对脑缺血的治疗作用及其对M受体信号通路的调节机制，旨在为脑卒中的治疗提供新靶点、新策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康♂大鼠(Sprague-Dawley，鼠龄60～90 d，体质量220～250 g)由中国科学院上海实验动物中心提供［SPF级，合格证书号:SCXK(沪)2002-0010］。

1.2 药品与试剂 PAE(纯度98.5%):购于中国药品与生物制品检定所。2，3，7-三苯基氯化四氮唑(TTC)购自 Sigma(Aldrich，St Louis，USA);TRI-REAGENT-LS试剂盒购自 Molecular Research Center，Inc.(Cincinnati，USA);RNasin、dNTP、Oligo(dT)18引物和 DNA polymerase购自 Sangon Biotechnology Co.(Shanghai，China);M-MuLV 逆转录酶购自 Fermentas，Inc.(Vilnius，Lithuania);DNA 荧光染 料SYBR Green I购自 Roche Co.(Mannheim，Germany);其它均为国产分析纯试剂。

1.3 实验分组 ① 模型组:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同时给予生理盐水(2 ml·kg－1，ip，14 days，每天两次)，即从缺血计算为0时，大脑中动脉梗死90 min后拔出丝线再灌24 h;于缺血0时给予生理盐水，连续14 d;② PAE治疗组:MCAO(90 min)，再灌注(24 h)，缺血同时给予PAE(2.5、5、10 mg·kg－1，ip，14 d，每天两次);③ 假手术组。n=8。大鼠生理指征如血氧、血糖等于MCAO前、MCAO过程中及再灌后30 min分别测定，实验过程中动物体温始终维持(37±1)℃。

1.4 大脑中动脉梗死模型的建立 参考Takano模型［5］，采用可逆性大鼠大脑中动脉栓塞法造成局灶性脑缺血模型。以水合氯醛(300 mg·kg－1，ip)麻?醉大鼠，颈部切口，游离颈外动脉，远端结扎。取头端呈圆球状4#尼龙线，由颈外动脉根部经颈内动脉向前延伸，插入约20 mm，遇到阻力停止。栓塞90 min后拔出栓线，再灌注24 h。

1.5 神经体征评分标准 根据 Sydserff等［6］神经体征评分:无明显体征(0分);将大鼠悬空观察，其损伤对侧前肢屈曲(1分);损伤对侧据抗推力下降(2分);提尾向损伤的对侧转圈但自由行走时不转圈(3分);自发性向损伤对侧转圈(4分)。

1.6 TTC染色后脑梗死体积的测定 将大鼠断头后，立即取出大脑，置－20℃约15 min，大脑作连续冠状切片(片厚2 mm)。脑片置于1%TTC(pH 7.2)37℃孵育10 min染色，10%甲醛溶液固定。数码相机拍照，测定脑梗死体积。

1.7 逆转录－多聚酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 采用RT-PCR技术对mRNA表达进行定量。再灌注24 h后分离皮层、海马和纹状体。TRIzol提取总RNA，逆转录反应液中如下:3 μl(1 μg)总RNA提取液，2 μl 10 mmol·L－1dNTPs，1 μl(1.6 μg)Oligo(dT)18作为引物，1 μl(20 U)RNase抑制剂(Promega，USA)，1 μl(20 U)M-MuLA 反转录酶及 4 μl 5 ×buffer。反应条件为:变性(94℃，30 s)，退火(68℃，30 s)，延伸(72℃，45 s)，共35个循环。以2%琼脂糖电泳分离，溴乙啶染色后用凝胶分析仪观察，以看家基因β-actin作为内参，计算相对光密度值。

2 结果

2.1 PAE对脑梗死体积及神经功能缺陷的影响

PAE对脑缺血/再灌注损伤(I/R)的治疗学作用如Fig 1 所示，PAE 在2.5、5 和10 mg·kg－1剂量14 d 治疗后，脑梗死体积分别降低为模型组的0.64倍、0.5倍及0.48倍(P＜0.01);神经功能评分分别降低为模型组的0.35倍、0.3倍和0.3倍(P＜0.01)。提示PAE对脑缺血/再灌注损伤具有良好治疗学作用。

2.2 对M受体基因表达的影响 PAE对不同脑区I/R后M受体基因表达的影响如Fig 2所示。在皮层、海马和纹状体，PAE治疗性给药14 d后与模型组相比，使M1受体基因表达分别增加1.78倍、1.87倍和1.58倍(P＜0.01);使M3受体基因表达分别增加3.5倍、3.2倍和3.07倍(P＜0.01);使M5受体基因表达分别增加3.9倍、1.6倍和1.38倍(P＜0.01)。

Fig 1 Effects of PAE on the size of cerebral infarct measured by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining after transient MCAO followed by reperfusion(±s，n=8)

进一步研究了PAE对突触前M2和M4基因表达的影响。在皮层和海马，PAE治疗性给药14 d后与模型组相比，使M2受体基因表达分别降低3.38倍和1.28倍(P＜0.01);在皮层、海马和纹状体，使M4受体基因表达分别增加2.05倍、1.55倍和1.23倍(P＜0.01)。

2.3 对G蛋白基因表达的影响 进一步研究了I/R及PAE治疗对与不同亚型M受体相偶联的G蛋白基因表达影响(Fig 3)。在3个脑区，I/R可诱导与M2和M4相偶联的Gi蛋白基因表达增高，PAE治疗给药14 d后抑制该病理性改变(P＜0.01);I/R和PAE对与M1、M3和M5相偶联的Gαq/11基因表达的影响与此相反。

Fig 2 Effects of PAE on M1～M5(A～E)muscarinic receptors gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

2.4 对ATP敏感性钾通道基因表达的影响 I/R可诱导Kir6.1基因表达上调及Kir6.2表达下调，导致Kir6.2/Kir6.1比值在脑缺血时下调，PAE逆转该病理改变(P ＜0.01，Fig 4)。

Fig 3Effects of PAE on Giα and Gq/11α gene expression after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3 讨论

3.1 调节M受体基因表达，促进兴奋性突触传递为其抗脑缺血新机制 根据M受体i3环结构、信号转导途径和生物效应的差异，M受体被分为2类。M1、M3和M5主要通过G蛋白－磷脂酶C-二酰基甘油/三磷酸肌醇(Gq-PLC-DAG/IP3)通路起作用，为M1组;M2和 M4激活 Gi/o-腺苷酸环化酶(AC)-cAMP信号通路，为M2组。中枢M1大量表达于皮层、海马和纹状体，通过影响皮层和海马之间的交互活动发挥调节记忆、学习等高级认知功能;M2主要分布在海马、脑干、丘脑等区域胆碱能神经元突触末梢，调控中枢乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)释放;M4主要表达于纹状体内，与多巴胺(DA)受体共存，抑制纹状体内DA释放、调控ACh介导的运动能力;M5全脑表达量不足2%，主要在海马及黑质DA能神经元表达［7］，脑微血管内皮细胞M5的激活介导大脑中动脉血管舒张反应，增加脑血流供应，M5基因敲除小鼠丧失脑血管舒张功能，对脑缺血损伤易感性增高［8］。

有报道，脑缺血1～3周后，脑血流明显降低，缺血的皮层M1受体数目降低，M受体结合力减弱［9］;双侧颈动脉结扎诱导的脑缺血小鼠，皮层M3、M5受体及胆碱乙酰基转移酶(ChAT)的mRNA表达降低［10］。但有关M受体及其信号转导系统与脑缺血的关系尚无系统报道。本文基于已有报道，系统研究了不同M受体亚型及其信号通路在脑缺血中的改变，并进一步探讨PAE的神经保护机制。

M1、M3和M5受体调节兴奋性突触传递，而M2和M4调节抑制性突触传递。PAE可上调脑缺血/再灌注损伤诱导的M1组受体-M1、M3和M5基因表达，逆转脑缺血诱导的与M1组受体偶联的Gα/11基因表达的降低，从而促进PLC生成，激活 IP3/Ca2+，升高胞内Ca2+浓度产生神经保护作用。与此相反，PAE下调脑缺血诱导的突触前M2受体基因表达，抑制其负反馈调节，从而促进ACh的释放，产生兴奋性突触效应，发挥神经保护作用;有报道M4受体位于海马的兴奋性突触末梢，海马脑片缺氧再灌注24 h后，CA1区M4受体的mRNA表达消失，谷氨酸能突触传递功能降低，与此同时观测到的M受体介导的兴奋性神经递质释放减弱相一致［11］(海马脑片再灌注20 h后，氨甲酰胆碱可抑制CA1区EPSP的生成)，因此，PAE对M4亚型的调节与M2相反，可明显抑制脑缺血诱导的M4受体基因表达的降低。

由此可见，PAE对M受体及其信号通路调节，最终产生共同效应，即促进兴奋性突触传递而发挥神经保护作用。

Fig 4 Effects of PAE on ATP-sensitive potassium(KATP)channel:Kir6.1，Kir6.2 gene expression and Kir6.2/Kir6.1 ratio after transient MCAO in cortex，hippocampus and striatum of rats(±s，n=4)

3.2 增加Kir6.2/Kir6.1比值为其发挥神经保护作用新途径 ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)由内向整流 K+通道家族(Kir6.1和 Kir6.2)及硫脲受体异构体(SUR1、SUR2A和SUR2B)组成，其开放是缺血预适应重要神经保护机制。大量研究表明KATP开放剂可明显减轻脑缺血后神经功能缺损，减少脑梗死体积，并通过抑制线粒体和死亡受体信号通路减少神经元凋亡，对脑缺血/再灌注损伤发挥保护作用［12］。海马CAl区对缺氧极为敏感，缺氧激活K+内流使细胞膜超极化，阻止Na+、Ca2+超载，细胞膜去极化和胞膜降解，而KATP有助于K+内流的激活。Kir6.2基因敲除小鼠在发生脑缺血15 min后即出现严重神经功能缺失症状，梗死体积明显大于Kir6.2(+/+)野生型小鼠，体外细胞试验也证实了这一点［13］;心肌缺血60 min/再灌注24 h的犬，心肌线粒体中Kir6.1蛋白表达水平上调［14］;离体培养的胎鼠前脑皮层神经元，以 Aβ1-42处理24 h后，免疫组化和Western blot研究均证明Kir6.1表达明显增加，而KATP开放剂二氮嗪则抑制其蛋白表达［15］。本研究也证实脑缺血可诱导Kir6.2基因表达下调及Kir6.1基因表达的上调，故Kir6.2/Kir6.1比值降低;PAE逆转上述病理改变，增加Kir6.2/Kir6.1比值，激活KATP通道发挥神经保护功能。

综上所述，芍药苷通过调节M受体—G蛋白—KATP通道发挥神经保护作用，具有发展为安全、有效、机制新颖的抗脑缺血候选药物应用前景。

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