APPβ分泌酶切割位点特异性单链抗体的制备和鉴定

黄 巍，周丽荣，周 婷，孙红霞，黄晓刚，刘 桥

(武汉市医学科学研究所基础医学研究室，湖北武汉 430014)

阿尔采末病(Alzheimer’s disease，AD)发病机制复杂，其中 β-淀粉样蛋白(amyloid β protein，Aβ)胞内外异常过量产生、聚集和沉积，是导致AD老年斑形成和神经元毒性的确切病理现象和重要诱因。Aβ由I型跨膜的淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经分泌酶水解代谢产生，按作用位点可分为α、β和γ 3种，α和β分泌酶(β-site APP-cleaving enzyme，BACE)先竞争性的水解 APP，然后γ分泌酶再水解剩下的APP片段产生各自代谢产物。Aβ由β和γ分泌酶依次水解APP产生［1］，具有毒性;α和γ分泌酶依次水解APP，产生的可溶性sAPPα肽和P3肽段则具有神经营养等作用。若APP的α和β代谢失去平衡，产生过多的Aβ，就容易诱发AD。

APPβ分泌酶切割位点是Aβ产生的关键位点，容易受到周围空间环境影响，如将Aβ抗体与APP结合，当抗体识别位点靠近Aβ的N端，即靠近APP的β切割位点，则Aβ的产生会受到干扰［2］，抗体识别位点正好为APPβ分泌酶切割位点序列时则作用更直接［3-4］，提示APPβ位点可以作为一个药物设计的良好靶点。我们在研制抗人APPβ分泌酶水解位点的单克隆抗体(mAb)的基础上［5］，进一步研制特异性单链抗体(ScFv)，ScFv相对mAb具有免疫原性弱，组织穿透力强，更容易通过血脑屏障等特点。APPβ分泌酶切割位点抗体与Aβ抗体在识别序列和减低Aβ机制上都有所不同，前者的目的是阻碍β分泌酶进入作用位点，切割APP产生Aβ，后者则是激活免疫系统，溶解清除已产生的Aβ，见Fig 1。

Fig 1 The delineation of APP degradation

1 材料与方法

1.1 材料 分泌抗人APPβ分泌酶水解位点单克隆抗体细胞株1A7和2H10［5］，以及稳定转染pEGFP-hAPP751(+4G)的 CHO细胞株(过表达人APP751和GFP融合蛋白)［6］由本室制备保存。限制性内切酶BamH I和EcoR I、pMD19-T克隆载体和逆转录酶M-MLV等为大连宝生物公司产品。引物合成与测序为上海英骏生物技术公司，高保真pfu酶和细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所，镍NTA Resin为上海博彩生物科技有限公司产品，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒为北京天根生化公司产品。APPβ位点序列多抗原短肽［ISEVKMDA］8由上海波泰生物科技公司合成，抗His的单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，抗His的兔多克隆抗体和Aβ肽(1-42)为北京博奥森生物公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 由于含linker序列的引物不利于扩增抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL基因，故先设计不含linker序列的引物扩增抗体的VH和VL片段，再以此为模板用含linker序列的引物扩增VH和VL，引物分别为:VHF(重链VH上游引物):5'-ATAGGATCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'(含 BamH I位点;W=A/T，S=G/C，M=A/C，R=A/G);VHB1(重链 VH下游引物，不含 linker序列):5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3';VHB(重链 VH下游引物，含 linker序列):5'-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3';VLF1(轻链 VL上游引物，不含 linker序列):5'-GACATCGAGCTCACCCAGTCTC-3';VLF(轻链VL上游引物，含linker序列):5'-CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACCCAGTCTC-3';VLB(轻链VL下游引物):5'-CGCGAATTCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTCCC-3'(含EcoR I位点)。引物VHB1和VLF1分别是VHB和 VLF中3'端序列的一部分，VHB和VLF中5'端部分为含有互补关系的linker序列，VHF和VLB分别含有BamH I和EcoR I酶切位点，便于拼接出来的ScFv构建载体。

1.2.2 VH和VL基因的克隆 分别提取1A7和2H10总 RNA，逆转录合成 cDNA。以 cDNA为模版，分别用VHF/VHB1和VLF1/VLB引物扩增出不带linker的序列，命名为VH1和VL1，回收纯化VH1和VL1片段，再以此为模板，用VHF/VHB和VLF/VLB引物，在高保真pfu酶作用下，分别扩增含linker序列的VH和VL片段。

1.2.3 ScFv的拼接 将VH和VL片段回收纯化，通过重叠延伸PCR(splicing by overlapping extension PCR，SOE-PCR)技术连接起来，即为ScFv片段，其主要过程如下:取等量纯化后的VH和VL片段与适量dNTP和Taq酶混匀，进行PCR反应，条件为:94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃1 min，共进行 7 个循环。然后，不必纯化直接取适量SOE-PCR反应液作为模板，用VHF/VLB引物大量扩增 ScFv片段。将PCR的产物与 pMD19-T克隆载体连接，转化DH5α，挑选阳性克隆测序。

1.2.4 ScFv表达载体的构建 以测序正确的ScFv克隆载体为模板，用VHF/VLB引物再次大量扩增ScFv片段，BamH I和EcoR I双酶切，回收纯化后与同样双酶切的pET-28a表达载体相连接，转化感受态DH5α，通过PCR、BamH I和 EcoR I双酶切和测序鉴定阳性克隆，命名为pET-ScFv(APPβ)。

1.2.5 ScFv的表达纯化及鉴定 将鉴定正确的pET-ScFv(APPβ)质粒转化表达菌株BL21(DE3)，筛选阳性菌落进行IPTG诱导表达，超声破碎离心收集上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析。结果表达产物以包涵体形式居多，目的蛋白带有his标签，通过镍柱纯化和复性，Western blot检测，一抗为抗His的单克隆抗体，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色。

1.2.6 可溶性ScFv生物活性的分析 通过ELISA分别检测ScFv对人APPβ分泌酶位点序列短肽的结合能力和对Aβ的交叉反应:以APPβ位点序列多抗原短肽［ISEVKMDA］8或 Aβ(1-42)包被酶标板，5 mg·L-1，每孔 100 μl，4℃过夜。洗板后，加可溶性ScFv，然后依次加抗His的兔多克隆抗体、HRP标记抗兔二抗，TMB显色并读取A450值。通过Western blot检测ScFv对人全长APP的结合能力:培养过表达人APP751和GFP融合蛋白的CHO细胞和过表达GFP的CHO细胞，裂解后行10%SDSPAGE电泳，湿转至NC膜，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，可溶性ScFv 4℃孵育过夜，洗膜后加抗His的单克隆抗体37℃ 2 h，洗膜，再加HRP酶标二抗37℃2 h，试剂盒显色。

2 结果

2.1 VH和 VL基因的克隆及 ScFv的拼接 从2H10中扩增出预期的约370 bp的VH1和330 bp的VL1条带，回收纯化后以各自为模板，分别扩增出含linker序列的大小分别约为410 bp和380 bp的VH和VL条带。将VH和VL回收纯化，经SOE-PCR拼接得到约750 bp的ScFv片段，见Fig 2。将2H10的ScFv与pMD19-T克隆载体连接，转化DH5α，挑选阳性克隆测序，测序正确的序列用于ScFv表达载体的构建。从1A7中没有扩增出预期的VH1，该株克隆中止。

2.2 表达载体pET-ScFv(APPβ)的构建和鉴定经筛选得到的阳性重组体命名为pET-ScFv(APPβ)，通过PCR可以扩增出约750 bp的条带，BamH I和EcoR I双酶切显示两个片段，分别是约5.5 kb和750 bp，与预计结果相同，见Fig 3。测序分析表明ScFv序列全长744 bp，编码248个氨基酸，轻重链基因序列符合小鼠抗体可变区的结构特点，表达载体阅读框正确，见Fig 4。

Fig 2 PCR product of VL1，VH1，VL，VHand ScFv gene from hybridoma 2H10

Fig 3 PCR product and the results of reconstruction vector pET-ScFv(APPβ)digested by BamH I and EcoR I

2.3 ScFv的表达纯化和鉴定 诱导表达产物进行12%SDS-PAGE分析，在约29 ku位置处出现新增条带。诱导表达菌经超声破碎离心收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析，结果表明表达产物主要为包涵体形式。通过镍柱纯化并复性后，可得到分子量约29 ku、纯度在90%以上的条带。目的蛋白通过his标签进行Western

blot检测，结果显示在分子量大小为29 ku处有特异条带，与预期ScFv蛋白情况相符，见Fig 5。

2.4 可溶性ScFv生物活性的分析 ELISA检测结果表明，分别包被APPβ位点序列多抗原短肽［ISEVKMDA］8和Aβ，ScFv能够与前者结合，与 Aβ 的结合反应则未能检测到。过表达人APP751和GFP融合蛋白的CHO细胞和过表达GFP的CHO细胞，裂解后行10%SDS-PAGE电泳，湿转至NC膜，封闭后，依次加可溶性ScFv、抗His单克隆抗体和酶标二抗孵育，增强型HRP-DAB显色。结果过表达APP细胞在约156 ku的地方出现条带，与预期的全长APP(约130 ku)+GFP标签(约26 ku)分子量之和一致，而稳定转染 GFP的细胞无任何条带，排除ScFv与GFP结合的可能，表明ScFv是可以与全长APP结合的，见Fig 6。

3 讨论

目前，有关阻断或清除胞内外异常增多Aβ的研究主要集中在APPβ及γ分泌酶抑制剂或RNA干扰［7-9］、Aβ抗体或疫苗等方向，但存在一些问题，如APP分泌酶除APP外，还有其它在正常生理活动中发挥重要功能的底物，抑制分泌酶活性有可能带来严重的副作用。APPβ分泌酶切割位点抗体为减少Aβ提供新的思路，当其与作用位点结合后，发挥空间位阻效应，阻碍β-分泌酶进入位点，致使Aβ无法产生，此方法通过阻碍水解酶进入特定位点而抑制其特定作用，由于不直接抑制水解酶的活性，特异性高副作用小，可为AD或其他新型药物设计或疫苗研究提供借鉴。

Aβ的产生有两大途径——分泌途径和内吞途径，β-分泌酶和位于高尔基体、细胞表面和内吞体等处的APP均能相互作用，在APP的分泌过程和胞膜APP内吞体形成与循环过程中水解APP生成Aβ［10-11］。APPβ 分泌酶位点单克隆抗体主要在内吞体循环过程中抑制Aβ产生，抑制率约50%［12］。本文进一步研制APPβ分泌酶位点小分子的ScFv，期望以后通过基因转染等方式将其导入胞内，还可在APP的分泌过程中抑制Aβ产生。本文制备的ScFv在抑制Aβ产生的同时还可能具有促进APPα代谢的潜能。虽然有报道指出APPβ位点单克隆抗体不能在阻断BACE作用的同时使APP朝α代谢途径发展［3］，但小分子的单链抗体或胞内抗体则不然，不但不会影响α位点水解，还有利于APP与α酶结合使其向α分泌途径发展。这是因为APP的α和β位点距离很近，α酶和β酶(或β位抗体)与相应位点结合时可能出现类似竞争性结合的情况。当β酶或β位单克隆抗体与β位点结合后，由于两者分子较大都会阻碍α酶与α位点的结合，故影响APP的α代谢;而小分子抗体由于空间位阻小，与β位点结合后既阻碍β酶进入β位点又方便α酶与α位点的结合，从而有利于APP的α代谢。关于这一点，识别位点靠近β位的抗Aβ胞内抗体的研究提供了有力的证据［2］，研究表明该Aβ抗体对α位点的水解有促进作用，因此，可以推断距离α位点较该Aβ抗体更远的β位点单链抗体或胞内抗体，对APPα分泌酶与α位点结合切割过程将会更有利。

Fig 4 The sequence of pET-ScFv(APPβ)

Fig 5 SDS-PAGE analysis and Western blot assay of pET-ScFv(APPβ)

Fig 6 Western blot analysis of the binding of soluble ScFv to the full length of hAPP

本文采用的是传统克隆抗体可变区的方法，即用一组简并引物进行扩增，结果两株杂交瘤细胞中只有2H10可以扩增出VH和VL基因并成功拼接出ScFv序列，而1A7扩增不出预期大小的VH(简并引物扩增VH时，有一条约700 bp的带，资料未显示)，说明抗体可变区高度可变，简并引物法不适用于某些抗体可变区序列的扩增，需要采用其他方法钓取抗体的可变区序列。在扩增VH和VL基因片段时，不宜直接使用含linker序列的引物VHB和VLF，否则由于引物太长导致二级结构复杂不利于片段扩增，导致扩增失败或效率过低不利于回收。本文先用不含linker序列的短引物VHB1和VLF1与各自配对引物扩增出目的片段VH1和VL1，经纯化后再各自为模板，用含linker序列的引物扩增相应的VH和VL片段，效果很好。用于扩增VH和VL的模板VH1和VL1必须要纯化，否则不利于VH和VL的扩增;而SOEPCR产物应直接用于PCR扩增ScFv序列，可以扩增出很亮的ScFv带，若纯化后再扩增ScFv，则容易出现带拖尾不集中等情况。ScFv与pET-28a表达载体相连接并在大肠杆菌中诱导表达，载体上His标签与ScFv融合，方便ScFv通过镍柱纯化和复性。ELISA和Western blot检测结果表明，可溶性ScFv与人APPβ分泌酶水解位点序列短肽和全长APP都有结合活性，对Aβ没有交叉反应，可以推断ScFv能够与全长APP的β分泌酶切割位点结合，这为进一步研究ScFv干预分泌酶对APP的水解过程奠定了基础。

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