光损伤后Caspase-3在RPE的表达及EPO对其的影响

姜文静，牛膺筠

(1.青岛市海慈医疗集团眼科，山东 青岛 266033;2.青岛大学医学院附属医院眼科，山东 青 岛 266003)

众所周知，适量的光线对视觉的形成是非常必要的。相反，如果光线的强度、光照的时间等超过了视网膜的承受力，那么将会造成视网膜的光损伤。光损伤后视网膜成分的丢失可能涉及凋亡，而Caspase-3是细胞凋亡的的必经之路。重组人促红细胞生成素(rhEPO)可抑制光化学损伤诱导的人RPE细胞的凋亡，对人RPE细胞的光化学损伤有保护治疗作用［1］。本课题建立光损伤模型，应用外源性EPO进行治疗，观察EPO与凋亡、Caspase-3的关系，探讨EPO的保护作用，为其临床应用治疗视网膜光损伤类疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 52只♂BALB/c小鼠，体质量12～20 g，随机分为对照组(4只)、单纯光照组(24只)和EPO预处理组(24只)3组。后两组按光照后处死时间的不同，分为6 h、12 h、36 h、72 h、96 h 和7 d 6 个亚组。

1.2 试剂 3 000 U/ml rhEPO(沈阳三生制药公司)，caspase-3兔IgG多抗(武汉博士德公司)，PV6001二步法免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 实验方法 将48只BALB/c小鼠放于6000LUX光照箱前，EPO预处理组和单纯光照组小鼠分别腹腔注射rhEPO和等量生理盐水，剂量为5 000 U·kg－1。光照箱由中国海洋大学光学研究室研制。分别于光照后6 h、12 h、36 h、72 h、96 h及7 d处死4只小鼠，摘除眼球，制作石蜡切片。同文献［2］。应用光镜HE染色法观察各组小鼠视网膜色素上皮层形态学的改变，常规免疫组织化学方法检测RPE中Caspase-3的表达变化。

1.4 统计学分析 采用SPSS10.0软件进行统计学分析，数据用±s表示，两组数据比较采用t检验。

2 结果

2.1 HE染色结果 正常BALB/c小鼠视网膜结构层次分明，RPE细胞呈单层线状排列，细胞形态规整。光照后各亚组随时间推移分别出现RPE细胞水肿，排列疏松，边界不清、形态不规则，后期出现核浓染、核破碎及丢失现象。EPO预处理组小鼠视网膜组织学改变较晚发生且不明显，光照后7 d也未见细胞丢失现象。

2.2 Caspase-3的表达变化 正常组没有检测到棕黄色的阳性染色;单纯光照后各亚组均可见到阳性表达细胞，且随光照后时间的推移阳性表达呈现逐渐递增的趋势，光照后96 h，caspase-3阳性细胞数达到最高峰;光照后7 d，Caspase-3蛋白的表达又开始下降。EPO预处理组仅光照后96 h组和7 d组有少量阳性细胞表达。两组同时间段相比较差别有统计学意义(P＜0.05)，见Tab 1。

Tab 1 Level of expression of Caspase-3 gene in retinal pigment epithelium within different time between light-induced group and EPO pretreatment group(The average optical density value，±s，n=8)

Tab 1 Level of expression of Caspase-3 gene in retinal pigment epithelium within different time between light-induced group and EPO pretreatment group(The average optical density value，±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control group

Time light-induced group EPO pretreatment group t P 6 h 18.88 ±3.14＊＊2.78 ±2.56 11.24 ＜0.01 12 h 24.83 ±4.53＊＊ 3.34 ±2.12 12.15 ＜0.01 36 h 44.92 ±3.64＊＊ 3.98 ±3.14 24.09 ＜0.01 72 h 92.26 ±4.67＊＊ 4.75 ±2.63 46.18 ＜0.01 96 h 297.28 ±2.23＊＊ 20.43 ±2.62＊＊ 227.59 ＜0.01 7 d 167.95 ±3.28＊＊ 15.78 ±3.96＊＊83.70 ＜0.01

3 讨论

本研究视网膜光损伤后，RPE细胞结构发生了重要的病理改变，视网膜光损伤所导致的色素上皮细胞的凋亡与Caspase-3蛋白酶的激活有着密切的关系。我们将rhEPO作为一种预处理因素应用到光损伤模型中，观察发现EPO可在一定程度上保护RPE功能，抑制细胞凋亡，从而对视网膜光损伤起到治疗作用。这与相关文献报道一致［3－6］。

综上所述，本实验结果证实了Caspase-3诱导视网膜光损伤后的色素上皮细胞凋亡，同时观察发现EPO可抑制Caspase-3蛋白的表达，减少色素上皮细胞的凋亡，推测这可能是EPO治疗视网膜光损伤的作用机制之一，从而为包括视网膜光损伤疾病在内的多种视网膜变性疾病的研究开辟了新的治疗手段。

［1］孟 岩，牛膺筠，周占宇，等.rhEPO对光损伤诱导的RPE细胞凋亡的抑制［J］.中国药理学通报，2007，23(10):1275－9.

［1］Meng Y，Niu Y J，Zhou Z Y，et al.Inhibition of light induced apoptosis of RPE cells by recombinant human erythropoietin［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(10):1275－9.

［2］王红云，牛膺筠，王培嵩，等.重组人促红细胞生成素对小鼠视网膜光损伤保护作用的研究［J］.中华眼科杂志，2005，41:434－8.

［2］Wang H Y，Niu Y J，Wang P S，et al.Erythropoietin administration protects retina against light-induced retinal degeneration［J］.Chin J Ophthalmol，2005，41(10):434－ 8 .

［3］Kawano T，Kato M.Electrophysiologic evaluation of retinal pigment epithelial damage induced by photic exposure［J］.Retina，2003，23(4):513－7.

［4］Becerra S P，Amaral J.Erythropoietin-an endogenous retinal survial factor［J］.N Engl Med，2002，347(24):1968－70.

［5］Nishiya D，Omura T，Shimada K.Effects of erythropoietin on cardiac remodeling after myocardial infarction［J］.J Pharmacol Sci，2006，101(1):31－9.

［6］Sepodes B，Maio R，Pinto R.Recombinant human erythropoietin protects the liver from hepatic ischemia-reperfusion injury in the rat［J］.Transpl Int，2006，19(11):919－26.