不同方法提取卵黄抗体效果的比较

吴 博，王 爽，樊兴冬，刘 宇，李 丹，史同瑞

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006)

禽卵黄抗体(egg yolk immunoglobulins，IgY)是禽类B淋巴细胞在抗原物质刺激下产生的沉积于卵黄中的一种免疫球蛋白［1］。由于卵黄抗体能够靶向清除病原，疗效理想且不产生毒副作用，不会激发补体系统，因此卵黄抗体已被广泛应用于动物疾病的诊断、预防和治疗工作。禽蛋黄中含有大量的蛋白质和磷脂等大分子结构物质，动物注射卵黄原液容易引起机体的肿胀、出血和坏死等严重的副反应。因此，应将卵黄中的免疫抗体与其他磷脂等物质分离，从中提取纯化卵黄抗体，以利于其应用和保存［2］。目前，分离提取IgY的常用方法主要包括有机物沉淀法、有机溶剂抽提法、中链脂肪酸法、水稀释法和无机盐沉淀法。为了寻找比较适合工业化生产的工艺方法，本试验比较了具有代表性、且成本低、效率较高的5种改进方法的IgY提取效果，以期为工业化生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳房炎病原菌高免蛋 用从患乳房炎病牛乳汁中分离鉴定的金黄色葡萄球菌制备灭活抗原，辅以弗氏佐剂后制成免疫原，间隔7～10 d连续三次强化免疫产蛋鸡，定期收取鸡蛋，应用试管凝集法测定卵黄抗体效价。收集效价合格的鸡蛋，贮存备用。

1.1.2 试剂与仪器 辛酸，东京化成工业株式会社生产;牛血清白蛋白(BSA)，北京元亨圣马生物技术研究所;其他试剂均为国产分析纯。紫外可见分光光度计(TU－1900)购自北京普析公司;酶标仪，美国宝特公司生产。

1.2 方法

1.2.1 卵黄抗体提取方法 用清水洗净高免鸡蛋，然后用0.5%新洁尔灭溶液浸泡消毒20 min，无菌条件下去除卵清蛋白和卵黄膜，收集卵黄，将卵黄置于容器中，制成匀浆后，分别按下述方法提取卵黄抗体。

1.2.1.1 水稀释法 取卵黄匀浆加6倍体积的蒸馏水，混合均匀，用1 mol/L的HCl调pH至5.0～5.2，搅拌均匀后均分4份，各取2份分置室温和4℃环境静置6～8 h，然后分别采用4000 r/min离心30 min和不离心两种工艺提取卵黄抗体。

1.2.1.2 辛酸法 取卵黄匀浆与倍量体积醋酸－醋酸钠缓冲液(pH 5.2，0.12 mol/L)混合均匀，然后向混合液中加入终浓度1% ～3%辛酸，混匀均匀，均分4份，各取2份分置室温和4℃环境静置6～8 h，然后分别采用4000 r/min离心30 min和不离心两种工艺提取卵黄抗体［3］。

1.2.1.3 乙酸－乙酸钠法 取卵黄匀浆加9倍体积醋酸 － 醋酸钠缓冲液(pH 5.2，0.12 mol/L)混合，搅拌10 min，均分4份，各取2份分置室温和4℃环境静置6～8 h，然后分别采用4000 r/min离心30 min和不离心两种工艺提取卵黄抗体［4－5］。

1.2.1.4 酚沉淀法 取卵黄匀浆与2.4%苯酚溶液按体积比1∶3比例混合均匀，均分4份，各取2份分置室温和4℃环境静置6～8 h，然后分别采用4000 r/min离心30 min和不离心两种工艺提取卵黄抗体。

1.2.1.5 海藻酸钠法 取卵黄匀浆与等体积蒸馏水混匀，然后与等体积0.1% ～0.14%海藻酸钠溶液(含0.04%NaCl)混合，用1 mol/L的 NaOH 或HCl调pH至5.2，均分4份，各取2份分置室温和4℃环境静置6～8 h，然后分别采用4000 r/min离心30 min和不离心两种工艺提取卵黄抗体［6－7］。

1.2.2 液体组分回收率测定 液体组分回收率是指用不同方法所提取回收的卵黄水溶性组分(WSF)与初始卵黄匀浆中加入液体量的比率。由于IgY溶于水，所以提取的液体量越多，即液体组分回收率越高，IgY提取量也就越多。

1.2.3 蛋白含量测定 以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白，采用考马斯亮蓝法(Bradford)测定上清液中的蛋白含量［8－9］。

按表1加入试剂，静置5 min后在波长595 nm处测定光密度值。以光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，在坐标轴上绘制标准曲线，并计算回归方程。

表1 绘制标准曲线不同编号试管所需试剂

取经室温静置离心提取的卵黄抗体待测样品，调整其测定的蛋白浓度值在标准曲线的线性范围内，根据所测定的595 nm处吸收值和相关系数，计算出待测样品的蛋白质浓度。

1.2.4 卵黄抗体效价测定 采用试管凝集试验测定不同方法提取卵黄抗体的抗体效价。用5%石碳酸生理盐水将提取的IgY水溶液作倍比稀释，然后加入等体积金黄色葡萄球菌凝集抗原，抗原浓度为2×109CFU/mL，同时用生理盐水对照，充分振摇混合后，置37℃温箱感作4～10 h，然后判定结果。

2 结果

2.1 卵黄抗体性状与回收率 试验结果表明，酚沉淀法提取的卵黄抗体液为无色澄清体液，其他4种方法提取的卵黄抗体液均为黄色、稍混浊体液。从提取量上看，辛酸法的液体回收率最高，达到171%。在室温或4℃环境静置不离心条件下，只有酚沉淀法有卵黄水溶性组分自然析出，其回收率分别为50%和38%(表2)。

表2 不同方法提取卵黄抗体液的物理性状及回收率

2.2 蛋白含量及卵黄抗体效价 将蛋白质BSA标准溶液系列浓度的光密度值(Y)与蛋白质浓度(X)进行线性回归，得回归方程 Y=0.619X －0.004，r2=0.994，标准曲线见图1。取适宜体积的待测样品，使其测定值在标准曲线的线性范围内。根据595 nm处OD值，在标准曲线上查出蛋白含量，并计算出浓度。试验结果表明，辛酸法提取蛋白的浓度最高，为6.6 mg/mL，而乙酸－乙酸钠法提取的蛋白浓度最低，为1.2 mg/mL。辛酸法和海藻酸钠法提取卵黄抗体的凝集效价最高，为1∶128，乙酸－乙酸钠法提取卵黄抗体的效价最低，为1∶16。具体结果见表3。

图1 测定蛋白质含量的标准曲线

表3 不同方法提取液蛋白含量及卵黄抗体效价

3 讨论

3.1 卵黄的主要成分是水、蛋白质和脂肪，其中蛋白质与脂肪的组分比约为1∶2，几乎所有的脂肪均与蛋白质结合形成了脂蛋白。在卵黄中只有α、β、γ卵黄球蛋白溶于水，IgY属于γ卵黄球蛋白，溶于水。根据IgY溶于水的特性，卵黄抗体应存在于提取的回收液及卵黄的水相中。本试验通过比较加入卵黄匀浆中液体的回收率，即提取液体的数量，探讨了5种提取方法的优劣。加入液体的回收率越高，提取的卵黄抗体亦越多，卵黄中IgY的提取也就越彻底;提取的液体越澄清，说明杂质去除得越彻底，IgY纯度也就越高。试验结果表明，辛酸法液体的回收率最高，达到171%，其次是酚沉淀法，回收率为105%。由此可见，辛酸法是提取效率较高的方法，其次是酚沉淀法和水稀释法，这与郑立勇等［10］的试验结果基本一致。

3.2 工艺条件试验表明，在室温和4℃环境静置条件下，4000 r/min离心30 min和不离心提取卵黄抗体，只有酚沉淀法有卵黄水溶性组分自然析出，其回收率分别为50%和38%，说明采用自然沉淀方法不适宜卵黄抗体的提取。在离心条件下，比较室温和4℃环境静置提取效果，结果提取量无显著差异，考虑生产成本和工艺优化，推荐采用室温静置离心工艺。氯仿法虽可采用自然沉淀法提取卵黄抗体，但考虑氯仿污染环境，对人体有毒，因而不适宜规模化生产。张伦等［11］研究了泊洛沙姆－辛酸法对鸡卵黄的脱脂条件，该方法采用过滤抽提工艺且不需离心，工艺简便，值得探讨和在产业化生产中应用。本试验尚未比较在卵黄匀浆与加入液体的不同体积比、卵黄混合液不同静置时间、不同离心速度条件下各种方法的提取效果，为了制定更加科学的生产工艺，还有待进一步试验。

3.3 在提取液蛋白含量及卵黄抗体效价试验中，辛酸法提取蛋白的浓度最高，为6.6 mg/mL，其次是海藻酸钠法，而乙酸－乙酸钠法提取的蛋白浓度最低，为1.2 mg/mL。辛酸法和海藻酸钠法提取卵黄抗体的凝集效价最高，为1∶128，其次是水稀释法和酚沉淀法，乙酸－乙酸钠法提取的卵黄抗体效价最低，为1∶16。由试验结果可见，随着回收液中蛋白质的含量增多，效价也相应增高，但因无法完全消除杂蛋白，所以抗体效价并不是随着蛋白含量完全成线性比例增加。在本试验中，虽然各种方法提取卵黄抗体的蛋白含量及其效价不同，但由于在提取卵黄抗体时各方法卵黄匀浆与加入液体的体积比存在差异，因此仅从提取原液的蛋白含量及效价尚不能直接说明方法的提取效果。试验有待将各方法提取的单位体积卵黄匀浆抗体进行浓缩，并调节至相同体积卵黄抗体液，然后再测定其蛋白含量及效价，以更加直观地证实提取效果。

3.4 在动物疾病的诊断和治疗方面，虽然卵黄抗体具有广阔的应用前景，但国内还没有关于卵黄抗体提取的科学生产工艺和产品质量标准，这在一定程度上限制了卵黄抗体的开发与应用。加快研究制订卵黄抗体产业化生产工艺和质量标准，有利于促进卵黄抗体产业化。目前，随着研究进展，卵黄抗体提取方法也在不断的发展与更新，但由于受到成本、安全性、产量和活性等诸多条件的限制，适用于大规模生产的方法并不多。衡量某一提取方法的优劣，要从工艺条件难易、工艺路线长短以及回收率和纯度等多方面综合评价。在本试验5种提取方法中，由于水稀释法、辛酸法、乙酸－乙酸钠法、酚沉淀法和海藻酸钠法的卵黄稀释倍数分别为1∶6、1∶1、1∶9、1 ∶3、1 ∶1，综合考虑卵黄稀释倍数、提取液体量、卵黄抗体蛋白含量、抗体效价及使用情况等因素，笔者认为辛酸法具有生产成本低、产品回收率高、对环境污染小等优点，比较适合工业化生产。

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