重组人白细胞介素－15摇瓶生产工艺优化

杨 梅，许崇利，2

(1.吉林化工学院环境与生物工程学院，吉林吉林 132022;2.吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062)

白细胞介素 －15(Interleukin－15，IL－15)是Grabstein［1］于1994年发现的一种细胞因子，与IL－2具有类似的生物活性。它具有促进T细胞、NK细胞和B细胞的增殖和分化，诱导淋巴细胞产生IFN－γ及TNF－α的作用［2］。近年来的研究表明，IL－15在抗肿瘤、抗微生物感染和治疗艾滋病等方面均有重要的作用［3－5］。人体多种组织和细胞均可表达IL－15，其中骨骼肌、胎盘、肾脏、骨髓基质细胞及脂多糖刺激的外周血单核细胞表达较丰富。IL－15有其自身高亲和力的特异性受体IL－15Rα，IL－15与其受体IL－15Rα的亲和力是IL－2与 IL－2 Rα 的 1000倍［2］，将有可能代替IL－2成为抗感染、抗肿瘤强有力的生物制剂。但是天然IL－15产量低、不易大量制备，为此本实验构建了表达IL－15蛋白的基因工程菌株，实现了高效表达，并对其表达条件进行了优化研究，从而为IL－15生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。

1 材料

1.1 菌株 菌株BL21(DE3)(pET28c(+)－IL－15)由吉林化工学院基因工程药物实验室构建。

1.2 培养基 M9Ⅰ培养基:1.6%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%磷酸氢二钾、0.1%磷酸二氢钾、0.01% 氯化铵、0.06% 硫酸铵、0.05% 硫酸镁、0.25%十二水磷酸氢二钠;M9Ⅱ培养基:0.5%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.5% 磷酸氢二钾、0.35% 磷酸二氢钾、0.35% 磷酸氢二铵、0.025% 硫酸镁、2 mol/L大肠杆菌用微量元素;M9Ⅲ培养基:0.5%酪蛋白、0.52%三水磷酸氢二钾、0.2%磷酸二氢钾、0.12%硫酸铵、0.05% 硫酸镁、0.02% 氯化铵、0.1%甘油、0.7% 十二水磷酸氢二钠、0.1mol/L 氯化钙、2 mol/L大肠杆菌用微量元素。

1.3 主要试剂 乳糖和卡那霉素(Kanamycin)购自Promega公司;β－巯基乙醇购自北方同正生物公司;蛋白Marker购自长春宝泰克生物公司;丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、过硫酸胺(AP)购自华美生物公司;凝胶成像仪、电泳仪购自Bio－Rad公司。

2 方法

2.1 摇瓶种子的培养 挑取BL21(DE3)(pET28c(+)－IL－15)单菌落转接至种子培养基中，50 mL锥形瓶中装入种子培养基20 mL(含50 μg/mL卡那霉素)，37℃ 200 r/min培养12～14 h。

2.2 摇瓶发酵培养 将培养好的种子液按2%接种量转接于发酵培养基中(250 mL锥形瓶中装入50 mL发酵培养基，含50 μg/mL卡那霉素)，200 r/min，37℃培养，37℃诱导。

2.3 不同发酵培养基对IL－15表达影响 将种子液按2%接种量分别接种于三种改良的M9培养基(M9Ⅰ、M9Ⅱ、M9Ⅲ)中，于37 ℃ 200 r/min培养，待菌体密度 OD600达到1.0时，加入终浓度为1.5 g/L的乳糖，继续培养4 h后取样，SDS－PAGE检测 IL －15 表达量［6－7］。

2.4 发酵初始pH对IL－15表达的影响 将M9Ⅱ发酵培养基 pH 值分别调为 6.5、7.0、7.5，然后分装于200 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，按2%接种，于37℃ 200 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.5 g/L的乳糖，继续培养4 h后，进行蛋白表达检测。

2.5 乳糖最佳诱导浓度对IL－15表达的影响将种子液按2%的接种量接种于M9Ⅱ发酵培养基中，于37℃ 200 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0 时，分别加入终浓度分别为 0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的乳糖，继续培养4 h后，进行蛋白表达检测。

2.6 诱导温度对IL－15表达的影响 将M9Ⅱ发酵培养基的pH值调整至7.0，然后分装于200 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，按2%的接种量接种BL21(DE3)(pET28c(+)－IL－15)种子液，分别于28、35、37 ℃ 200 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.5 g/L的乳糖，继续培养4 h后，进行蛋白表达检测。

2.7 培养和诱导时间对IL－15表达的影响 将种子液按2%的接种量接种于M9Ⅱ发酵培养基中，于37℃ 200 r/min培养，待菌体密度OD600达到1.0时，加入终浓度为1.5 g/L的乳糖，分别于1、2、3、4、5 h取样，进行蛋白表达检测。

3 结果

3.1 不同发酵培养基对IL－15表达影响 如图1所示，IL－15在三种改良的M9发酵培养基中均有表达，但在M9Ⅱ培养基中的表达量最高，利用GDS－8000凝胶成像分析系统软件分析，IL－15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量30.2%(图1)。

图1 不同培养基发酵液SDS－PAGE电泳图

3.2 发酵初始pH对IL－15表达的影响 如图2所示，不同初始pH值对IL－15蛋白表达水平有明显影响，其中pH值为7.0时，IL－15蛋白表达量最高，利用GDS－8000凝胶成像分析系统软件分析，IL－15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的29.6%(图2)。因此，选择 pH 7.0为最佳初始pH值条件。

3.3 诱导剂浓度对IL－15表达的影响 如图3所示，不同的乳糖浓度对IL－15蛋白表达量的影响不同，当乳糖浓度达到1.5 g/L时IL－15蛋白表达量最高，利用GDS－8000凝胶成像分析系统软件分析，IL－15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的32.3%(图3)。因此乳糖浓度控制在1.5 g/L较好，可以得到更高的表达水平。

图2 不同pH值发酵液SDS－PAGE电泳图

图3 不同浓度乳糖诱导发酵液SDS－PAGE电泳图

3.4 诱导温度对IL－15表达的影响 如图4所示，不同培养温度对IL－15蛋白表达量有较大的影响，当培养温度为37℃时IL－15蛋白表达量最高，利用GDS－8000凝胶成像分析系统软件分析，IL－15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量36%(图4)。考虑到菌体生长速度，最后确定摇瓶培养温度为37℃，诱导温度为37℃。

图4 不同培养温度发酵液SDS－PAGE电泳图

3.5 不同培养、诱导时间对IL－15表达的影响在对数生长前期进行诱导，最有利于菌体生长和产物表达。只有工程菌处于对数生长时期，目的蛋白表达水平才最高，一旦工程菌进入稳定生长期再升温，目的蛋白表达水平反而会迅速下降。如图5所示，当诱导时间为4 h时，IL－15蛋白表达量最高，利用GDS－8000凝胶成像分析系统软件分析，IL－15蛋白的表达量占菌体总蛋白相对含量的30.7%。因此，选择4 h为最佳诱导时间。

图5 不同诱导时间发酵液SDS－PAGE电泳图

4 讨论

乳糖以其无毒、价廉的特点，使得人们期望能够利用乳糖作为工业化生产的诱导物。然而，由于乳糖本身会引起细胞在转运以及生理代谢等方面的一系列复杂的变化，需要对菌体生长及诱导条件进行更为精细的研究及优化。本文深入研究了以乳糖作为诱导剂时，对T7启动子调控的重组产物表达及菌体生长的影响及其规律，从中分析并寻找出适宜的诱导条件及诱导物浓度。

摸索摇瓶发酵条件对确定发酵罐发酵工艺有着一定的借鉴意义［8－10］，本实验优化的发酵条件为发酵起始pH值7.0、培养温度37℃、乳糖诱导浓度1.5 g/L、菌体生长密度OD600达到1.0时加入乳糖、诱导时间为4 h。本实验优化的发酵条件是稳定的，在后续的工作中，可以此为方向进行发酵罐发酵工艺的摸索，从而为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物IL－15的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。

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［9］ 许崇利，欧阳红生，许崇波，等.重组人γ－干扰素基因工程菌发酵工艺优化［J］.中国兽药杂志，2011，45(11):26－30.

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