HPLC法测定兽用中药散剂中非法添加利巴韦林的方法研究

李树纲，金录胜，汪 洋，张 旭，张 宏，武生平

(1.甘肃省兽药饲料监察所，兰州 730030;2.兰州市卫生学校，兰州 730030;3.甘肃农业大学，兰州 730070﹚

利巴韦林(Ribavirin)是核苷酸类药物，又名病毒唑、三氮唑核苷等，其化学结构与鸟苷相似，化学名为1－β －D－呋喃核糖基 －1Н －1，2，4－三氮唑－3－羧酰胺，是抗病毒药，作用机理尚未完全明确。本品在体外具有抑制呼吸道合胞病毒、流感病毒、甲肝病毒、腺病毒等多种病毒生长的作用，进入体内对呼吸道合胞病毒也可能具免疫作用和中和抗体作用，其并不改变病毒吸附、侵入和脱壳，也不诱导干扰素的产生［1］。本品有较强的致畸作用，能引起胚胎损害，大剂量应用可致心脏损害等，属于禁用兽药。利巴韦林等人用抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效的实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施。目前，一些不法分子在兽用中药制剂中非法大量添加抗生素、抗病毒药等化学药品，这不仅违反了《兽药管理条例》，而且易造成耐药性的产生及动物性食品中药物残留，最终给人类身体健康造成了巨大的危害。本文旨在研究建立HPLC法测定兽用中药散剂中非法添加利巴韦林的分析方法［2］。

1 试药与仪器

1.1 试药

1.1.1 对照品 利巴韦林对照品，批号为629－200202，来源于中国药品生物制品检定所。

1.1.2 供试品

1.1.2.1 阴性对照散剂 白龙散、白头翁散、苍术香连散、扶正解毒散、四味穿心莲散、麻杏石甘散、黄连解毒散，购买合格药材按《中国兽药典》2010年版二部规定的处方自配。

1.1.2.2 阳性添加散剂 阳性添加散剂按照0.2 g/kg的比例在1.1.2.1项配制的散剂中添加利巴韦林对照品，混匀。

1.1.3 试剂 硫酸，分析纯，北京化工厂。

1.2 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent 1100可变波长紫外检测器);ZORBAX SB－C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);UF 型超纯水机;TG18G台式高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司，最大转速为18000 r/min);电子天平(梅特勒－托利多仪器(上海)公司，AE240感量为0.00001，AE100感量为0.0001);实验室 pH计(FE20，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 分别称取1.1.2项下的供试散剂1.0 g，置50 mL离心管中，精密加入流动相 20 mL，涡旋混匀，振摇提取 10 min，8000 r/min离心10 min，滤过，作为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取利巴韦林对照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解，用流动相稀释至刻度，作为对照品贮备液(0.2 mg/mL)，用时根据需要稀释成相应的浓度。

2.2 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以水(用稀硫酸调节pH值至2.5 ±0.1)为流动相;流速 1.0 mL/min;进样量20 μL;紫外检测器检测波长 207 nm［3］。按 2.1 项下的方法分别制备供试品溶液和对照品溶液，在上述色谱条件下，对其进行了进样分析，利巴韦林主峰的保留时间为7.511 min，能够与供试品中其他成分色谱峰很好地分离，峰形良好(图1～图15)。

2.3 线性范围 分别精密吸取2.1.2项下的对照品贮备液 1.00、2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 mL，置200 mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，配制系列标准溶液。按实验确定的最佳条件进行测定，依照浓度由小到大的次序，按上述色谱条件进样分析，以系列标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程为Y=5.68×10X－5.61 ×10－2(r=0.9999，n=6)，结果表明利巴韦林在1.016 ～ 20.32 μg/mL 范围内线性关系良好(图16)。

图16 利巴韦林的标准曲线

2.4 精密度试验［4］取利巴韦林对照品溶液，按上述色谱条件重复连续进样6次，每次进样量为20 μL，测定峰面积，RSD 为 0.19%，表明此方法的仪器精密度符合要求。

2.5 重现性实验［4］取同一品种的同一批供试品各5 份，按2.1.1 和2.1.2 项下操作，测定利巴韦林的峰面积，RSD为1.08%，表明此方法的重现性良好。

2.6 溶液稳定性实验 将同一供试品溶液3个不同浓度的溶液在室温下考察，按上述色谱条件，分别于 1、3、6、10、24 h 测定峰面积，利巴韦林主峰面积的 RSD 分别为0.30%、0.26%、0.38%，表明24 h内利巴韦林在供试品溶液中是稳定的(图17～图18)。

2.7 检测限 按2.1.1项下的方法制备一定浓度的白龙散、白头翁散、苍术香连散、扶正解毒散、四味穿心莲散、麻杏石甘散、黄连解毒散供试品溶液进行检测，以信噪比(S/N)≥3为检测限(LOD)，检测限为2 mg/kg。

2.8 加样回收率试验 分别按 0.1、0.2、0.4 g/kg的添加浓度精密称取利巴韦林对照品，加入1.1.2.1项下的自制散剂中，每个浓度做5份平行样，按2.1.1项下的方法制备供试品溶液，与对照品平行进样分析，按外标一点法，计算回收率及批内变异系数。本方法的回收率为81.28% ～119.46%，变异系数为0.88% ～1.65%(表1)。

3 讨论

根据利巴韦林在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚或二氯甲烷中不溶的特点，而且大多数中兽药成分在水中不溶，因此，以流动相为溶剂溶解提取兽用中药散剂中添加的利巴韦林，散剂中的其他组分峰与利巴韦林主峰的分离度符合要求，不影响利巴韦林的检测。供试品中利巴韦林的提取以振摇提取10 min，8000 r/min离心10 min为好，从兽用中药散剂中同时提取出的组分种类较少，不干扰利巴韦林的检测。建立快速、灵敏、专属的分析方法，为定性检测和定量分析兽用中药散剂里非法添加的西药成分，具有重要的意义。本文研究建立了HPLC法测定兽用中药散剂中非法添加利巴韦林的分析方法，简便、快速，具有一定的实用价值。

表1 兽用中药散剂中添加回收率试验结果(n=5)

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典二○一○年版二部［S］.

［2］ 胡 娟，庞文生，陈博毅，等.中成药中非法添加利巴韦林检测方法的研究［J］.福建中医学院学报，2006，16(1):39 －41.

［3］ 傅 强.药物分析试验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，2008:7.

［4］ 杨秀玉，万仁玲，马玉叶，等.高效液相色谱法定性检测5种中兽药散剂中违规添加的氯霉素［J］.中国兽药杂志，2006，40(12):11－14.