不同动物源性链球菌的耐药性分析

赵 晴，孔令聪，马红霞，2，高云航，林雁春

(1.吉林农业大学动物科技学院，长春 130118;2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春 130118)

链球菌是临床上常见的病原菌之一，其中猪源链球菌是一种重要的人畜共患病的病原［1］，牛源链球菌感染极大地增加了奶牛乳房炎的治疗成本，被称为奶牛业的“致命杀手”。随着抗菌药物在治疗中的不合理应用，特别是某些抗菌药物被作为饲料药物添加剂使用，导致多重耐药性链球菌菌株不断出现，且耐药率高、耐药谱广，不仅给我国养殖业造成了非常严重的经济损失，而且加剧了抗菌药物在动物体内的残留，严重危害了动物食品安全［2］。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 质控株 链球菌CVCC3307，购自中国兽医药品监察所微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 菌株 于2010年10月至2011年8月从吉林地区分离获得28株动物源性链球菌。

1.1.3 药品及试剂 青霉素、红霉素、新诺明、氟苯尼考、多西环素、环丙沙星、克林霉素7种抗菌药物均由北京海洋医化生物科技有限公司惠赠。Tryptone(Typical analysis)、Yeast Extract(Typical analysis)为Oxoid公司产品;特级犊牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品;琼脂粉为北京奥博星生物技术有限责任公司产品;氯化钠、氢氧化钠等均为国产分析纯试剂。

1.1.4 主要仪器 HS－840u型水平层流单人净化工作台(苏州净化设备有限公司)，SHA－B国华企业恒温振荡器(国华科学仪器有限公司)，AUY220型电子天平(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制 血琼脂培养基按参考文献［3］进行配制。

1.2.2 病原菌的分离鉴定 分别将疑似猪源链球菌感染的病猪病变器官(心、肝、脾、肺)、脓汁鼻液及患有奶牛乳房炎病牛的乳液接种于血清琼脂板中进行增菌培养18～24 h。取培养后的疑似菌落进行革兰氏染色镜检，如镜检发现有革兰氏阳性菌并呈链球状排列时，进行进一步纯培养并观察其菌落形态，最后通过生化试验鉴定其为链球菌属。

1.2.3 菌落计数 采用常规方法进行菌落计数［4］。

1.2.4 抗菌药物的制备 青霉素、环丙沙星、克林霉素、多西环素用蒸馏水溶解稀释，其中青霉素现用现配，稀释至12.80256 IU;红霉素先用少量乙醇溶解，再用pH 7.8缓冲液稀释;氟苯尼考先用甲醇溶解，再用蒸馏水稀释。以上药物稀释至7680 μg/mL。新诺明先用0.1%NaOH溶液溶解，再用蒸馏水稀释至 122880 μg/mL。

1.2.5 琼脂二倍稀释法测定28株链球菌的MIC将已制备好的抗菌药物用生理盐水进行倍比稀释，制备含药琼脂。将纯培养菌制成悬液，根据菌落计数结果，将菌液稀释成适当浓度(1×104～5×105CFU/mL)范围内，分别接种于含药琼脂板上37℃培养18～24 h，观察细菌生长情况，确定7种抗菌药物对28株链球菌的MIC，进行3次重复，按美国临床检验标准委员会(NCCLS)的标准判断结果。

2 结果

2.1 链球菌的分离鉴定 通过镜检、生化试验鉴定共分离鉴定得到18株猪源链球菌及10株牛源链球菌，分别采自长春、吉林、四平、松源、九台、德惠等地区猪场及双阳、九台、吉林、四平、公主岭、梅河等地区奶牛场。

2.2 7种抗菌药物对28株不同动物源性链球菌的MIC(表1) 琼脂二倍稀释法测定28株链球菌的MIC结果显示，从吉林省地区分离的28株动物源性链球菌表现出不同程度的耐药性，耐药水平较高。对红霉素的MIC为敏感株的100倍以上的受检菌株占总菌株数的57.14%，对克林霉素的MIC为敏感株的100倍以上的受检菌株占总菌株数的53.57%，对青霉素的MIC为敏感株的100倍以上的受检菌株占总菌株数的35.71%，对多西环素的MIC为敏感株的10倍以上的受检菌株占总菌株数的75%，对新诺明的MIC为敏感株的10倍以上的受检菌株占总菌株数的67.85%，对环丙沙星的MIC为敏感株的10倍以上的受检菌株占总菌株数的53.57%，对氟苯尼考的MIC为敏感株的10倍以上的受检菌株占总菌株数的14.28%。

表1 7种抗菌药物对28株动物源性链球菌的MIC μg/mL

2.3 动物源性链球菌对7种抗菌药物的耐药谱(图1)28株受检菌株绝大多数为多重耐药株。对2种抗菌药物耐药的菌株占7.14%，对3种抗菌药物耐药的菌株占10.31%，对4种抗菌药物耐药的菌株占21.43%，对5种抗菌药物耐药的菌株占21.43%，对6种抗菌药物耐药的菌株占14.28%，对7种抗菌药物耐药的菌株占21.43%。

图1 动物源性链球菌对7种抗菌药物的耐药谱

2.4 动物源性链球菌对7种抗菌药物的耐药率(图2)28株动物源性链球菌对青霉素的耐药率最高(92.86%)，其次为多西环素和环丙沙星(82.14%)、新诺明(75%)、红霉素(67.86%)、克林霉素(57.14%)，耐药率最低的为氟本尼考(35.17%)。

图2 动物源性链球菌对7种抗菌药物的耐药率

3 讨论

采用琼脂二倍稀释法检测动物源性链球菌对7种抗菌药物敏感性的结果表明，28株不同动物源性链球菌中，仅一株为临床分离药物敏感株，其他菌株均对2种以上抗菌药物耐药，对5种以上抗菌药物耐药的菌株占21.43%，绝大多数呈多重耐药性。受检菌株对氟苯尼考的耐药性相对较低，这可能与氟苯尼考投入兽医临床的时间相对较短，使用频率相对较低有关。这种耐药情况与国内外相关报道结果基本一致。Marie等［5］分别检测了从法国临床病猪及不同国家病人体内分离的猪链球菌，对于临床常用的13种抗菌药物进行耐药性检测，检测结果表明，耐药性最为严重的是多西环素、大环内酯类抗生素。Dong等［6］检测了从韩国屠宰猪体内分离得到的猪链球菌对于临床常用的7种抗菌药物的敏感性，结果表明，对四环素、庆大霉素和大观霉素均耐药。杨晓莉等［7］在宁夏地区分离得到奶牛乳房炎链球菌，并做了耐药性检测，结果显示，没有对17种药物都敏感的菌株和单药耐药菌株，对6种以上抗菌药物耐药的菌株占90%。

研究结果表明，受检猪源链球菌对红霉素耐药水平高(MIC＞512 μg/mL)，但对青霉素耐药水平较低，可能是某些养殖场为了预防猪肺疫等疾病，将大环内酯类药物作为饲料药物添加剂进行饲喂，导致猪源链球菌对大环内酯类药物的耐药水平升高。受检牛源链球菌对青霉素耐药水平高(MIC＞512 μg/mL)，但对红霉素敏感，其结果可能与第四代头孢菌素类抗感染药物的广泛使用有关，导致β－内酰胺类药物耐药水平增高。动物源性病原菌的耐药谱及耐药水平可能发生时间性地变迁，即长期使用某种抗菌药物造成高度耐药后，停止使用该类药物一段时间后，细菌可能恢复对该类药物的敏感性。建议临床用药时可以更替选择病原菌敏感药物进行相应疾病治疗。

吉林省不同动物源性链球菌耐药性检测结果提示，目前吉林省部分地区猪链球菌病可选用青霉素治疗，链球菌所致的奶牛乳房炎可选用红霉素或克林霉素治疗，也可选用受试菌均较敏感的氟苯尼考进行该疾病的治疗。因上述受试菌的采集地有限，建议在养殖生产中，应通过药敏试验筛选有效的抗菌药物进行链球菌病的治疗以杜绝滥用药物，从而减少耐药性的直接和间接传播。设法研制链球菌多重耐药抑制剂，延长抗菌药物的使用时间已迫在眉睫［8－9］。

［1］ 刘荻萩，李艳华，蔡雪辉，等.链球菌对抗生素产生耐药性的作用机制［J］.国外医药(抗生素分册)，2007，28(3):103 －107.

［2］ Dziva F，Muhairwa A P，Bisgaard M.Diagnostic and typing options for investigating diseases associated with Pasteurella multocida［J］.Veterinary Microbiology，2008，128(1/2):1 －22.

［3］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，1994:1340.

［4］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，2006:1649－1650.

［5］ Marie J，Morvan H，Berthelot－ Heraultf，et al.Antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from swine in France and from humans in different countries between 1996 and 2000［J］.J Antimicrob Chemother，2002，50(2):201 －209.

［6］ Han D U，Choi C，Ham H J，et al.Prevalence，capsular type and antimicrobialsusceptibility ofStreptococcussuisisolated from slaughter pigs in Korea［J］.Can J Vet Res，2001，65(3):151 －155.

［7］ 杨晓莉，王桂琴，侯鹏霞，等.奶牛乳房炎链球菌分离鉴定及药敏试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2010，(10):56 －57.

［8］ 马红霞，邓旭明，李乾学，等.吉林省动物病原性大肠杆菌的耐药性监测试验［J］.吉林农业大学学报，2001，23(4):85－88.

［9］ 马红霞，贾绍娟，刘玉堂，等.不同动物源性大肠杆菌的耐药性检测［J］.中国兽医杂志，2008，44(6):81 －83.