MicroRNA-93在骨肉瘤组织中的表达及其意义

何 敏 刘水红 杨志强 高志增

骨肉瘤是原发性骨恶性肿瘤中最常见的一种，约占骨恶性肿瘤的1/3。其恶性程度较高，是严重影响劳动生产力并危及生命的重要肿瘤之一，早期诊断及早期治疗具有特别重要的意义[1]。MicroRNAs（miRNAs）是内源性非编码RNA经过一系列加工后产生的一类大小约20～25个核苷酸单链的小分子RNA，其功能为调控基因转录后的表达[2]。在恶性肿瘤发生发展中，miRNAs扮演着“癌基因”和（或）“抑癌基因”的重要角色[3-5]。本研究拟采用TaqMan MGB探针法检测miR-93在骨肉瘤组织中的表达情况，同时转染miR-93过表达载体及利用反义技术降低骨肉瘤细胞miR-93的表达，观察其生长及细胞周期变化情况，以便为骨肉瘤早期诊治提供新的理论和试验基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料 收集2009年9月—2011年11月南昌大学第一附属医院骨外科38例骨肉瘤及对应软骨组织手术标本，所有标本均经病理学检查确诊，其中男25例，女13例，年龄11～47岁。

1.2 试剂和仪器 TaqMan miRNA分析试剂盒（美国ABI公司）；DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国Hyclone公司）、脂质体 LipfectamineTM2000及真核载体pcDNA5-FRT（美国Invitrogen公司）；反义miR-93寡核苷酸（AMO-miR-93，大连宝生物公司）；人骨肉瘤细胞系 U2-OS和MG-63购自上海中科院细胞库；实时荧光定量PCR分析仪7500（美国ABI公司)，流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测miR-93的表达 采用Trizol试剂提取组织总RNA，紫外分光光度计测定浓度，-70℃保存备用，用miR-93检测试剂盒检测miR-93的表达。首先取2μg总RNA作为模板与3μL逆转录酶混合，在20μL反应体系中，16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行逆转录反应。收集cDNA，然后将cDNA 150倍稀释，取1μL稀释的cDNA与2μLTaqMan引物混合，20μL反应体系：95℃ 10 min，随后 95 ℃ 15 s，61℃ 60 s，40 个循环。相对 miRNA 表达水平用循环阈值（Ct值）准确计算，U6小核RNA为内参。

1.3.2 miR-93过表达载体的构建 利用人骨肉瘤细胞U2-OS的cDNA扩增出miR-93前体序列，miR-93上游引物：5′-AGTCTCTGGCTGACTACATCACAG-3′；下游引物 ：5′-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3′。PCR产物纯化后，用Bam HⅠ和XhoⅠ对产物及载体pcDNA5-FRT双酶切。酶切产物纯化后用T4连接酶连接，然后转化感受态细菌DH5α。转化菌涂布于含氨苄青霉素抗性的溶菌肉汤培养基（LB固体培养基）琼脂平皿涂板，倒置平皿，于37℃中培养16 h。挑取单菌落摇菌，质粒小提，送公司测序验证，选取构建正确的质粒。

1.3.3 反义miR-93单核苷酸序列设计 根据miRBase提供的 miRNA基因序列（http://www.sanger.ac.uk/software/Rfam/miRna），获取人miR-93序列，设计相应的反义寡核苷酸序，采用核酸序列数据库检索程序排除其他的可能同源序列。同时再确定 1条随机的对照序列。miR-93反义序列：5′-CTACCTGCACGAACAGCACTTT-3′。随机上游序列 ：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；随机下游序列 ：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，提交大连宝生物公司合成，纯化，全硫代修饰。

1.3.4 细胞株的培养及转染 U2-OS和MG-63细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养。严格按照脂质体LipfectamineTM2000转染试剂说明书进行转染，反义miR-93寡核苷酸终浓度分别为：50、100、150、200 nmol/L，初步筛选出最佳终浓度为100 nmol/L。

1.3.5 转染miR-93过表达载体及反义miR-93单核苷酸后对miR-93表达的影响 实验分为空白对照组、随机对照组、过表达组及AMO-miR-93组。后2组分别转染miR-93过表达载体及反义miR-93单核苷酸48 h后，抽提总RNA经纯度分析，逆转录为cDNA，测定cDNA浓度。用miR-93检测试剂盒检测miR-93的表达（具体条件同上）。

1.3.6 MTT检测各组细胞的增殖 收集U2-OS和MG-63细胞，在离心管内将各组细胞悬液充分打匀，按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200μL，24 h后换液。实验分组同1.3.5，每组设6个复孔。于转染后1～3 d每孔加入5 g/L MTT试剂20μL，于37℃，5%CO2条件下继续孵育4 h。吸取各孔上清，加入DMSO 150μL/孔，室温下置水平摇床摇10 min以充分溶解MTT结晶。在酶联免疫测定仪上选择波长490 nm，空白孔调零，测定各孔光密度（OD）值。每组重复3次。按下列公式计算细胞生长抑制率（%）：

1.3.7 流式细胞术分析细胞周期变化情况 实验分组同1.3.5。细胞接种6孔板，分别转染miR-93过表达载体及反义miR-93单核苷酸48 h后收集细胞，制成单细胞悬液，PBS洗2次，离心，弃上清，加PBS重悬细胞，加-20℃预冷的75%乙醇并振荡，4℃固定1 h，离心，弃冰乙醇，PBS洗1遍，弃上清；加入含有50 mg/L碘化吡啶（PI）和100 mg/L无DNA酶污染的RNA酶PBS染色液，4℃避光静置1 h，上机检测。每组重复3次。

1.4 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间均数比较采用t检验；多组均数间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织miR-93的表达情况 在38例骨肉瘤及对应软骨组织中65.8%（25/38）骨肉瘤组织miR-93的表达明显高于相对应的软骨组织，差异有统计学意义（t=2.76，P<0.05），见图1。

Figure 1 The expression of miR-93 in osteosarcoma and cartilaginous tissues图1 骨肉瘤组织及软骨组织中miR-93的表达情况

2.2 miR-93过表达载体或AMO-miR-93转染后miR-93表达 过表达组U2-OS和MG-63中miR-93表达水平较空白对照组增高 （P<0.01）；AMO-miR-93组中miR-93表达较空白对照组降低 （P<0.01），而空白对照组与随机对照组间差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 miR-93过表达载体或AMO-miR-93作用后对骨肉瘤细胞生长的影响 转然后1～3d，过表达组骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63的增殖明显快于空白对照组，而AMO-miR-93组骨肉瘤细胞的增殖明显慢于空白对照组（P<0.01）；空白对照组与随机对照组间骨肉瘤细胞的生长差异无统计学意义（P>0.05），见表2、3。

Table 1 The expression of miR-93 in U2-OSand MG-63 cells treated with different conditions表1 不同因素处理U2-OS和MG-63细胞后miR-93表达情况 （n=3，±s）

Table 1 The expression of miR-93 in U2-OSand MG-63 cells treated with different conditions表1 不同因素处理U2-OS和MG-63细胞后miR-93表达情况 （n=3，±s）

**P<0.01

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Table 2 The optical density of cell proliferation in different treated U2-OScells表2 不同因素处理U2-OS细胞后增殖率OD值（n=3，±s）

Table 2 The optical density of cell proliferation in different treated U2-OScells表2 不同因素处理U2-OS细胞后增殖率OD值（n=3，±s）

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Table 3 The optical density of cell proliferation in different treated MG-63 cells表3 不同因素处理MG-63细胞后增殖率OD值（n=3，±s）

Table 3 The optical density of cell proliferation in different treated MG-63 cells表3 不同因素处理MG-63细胞后增殖率OD值（n=3，±s）

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2.4 转染miR-93过表达载体或AMO-miR-93后骨肉瘤细胞周期变化情况 过表达组较空白对照组U2-OS和MG-63细胞的G0/G1期比例明显降低，而S期的细胞比例明显增加（P<0.01）；AMO-miR-93组较空白对照组细胞G0/G1期比例明显增加，而S期和G2/M期细胞比例明显降低（P<0.01）。空白对照组与随机对照组间差异无统计学意义（P>0.05），见表4、5。

Table 4 The cell cycle of U2-OScells in four groups表4 4组U2-OS细胞的细胞周期变化 （n=3，%，±s）

Table 4 The cell cycle of U2-OScells in four groups表4 4组U2-OS细胞的细胞周期变化 （n=3，%，±s）

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Table 5 The cell cycle of MG-63 cells in four groups表5 4组MG-63细胞的细胞周期变化 （n=3，%，±s）

Table 5 The cell cycle of MG-63 cells in four groups表5 4组MG-63细胞的细胞周期变化 （n=3，%，±s）

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3 讨论

miRNAs可通过调控基因表达来参与生命过程中的一系列重要进程，包括早期发育、细胞增殖、凋亡、分化以及死亡。miRNAs通过与靶mRNA的3′非编码区近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。多种癌症中存在miRNAs的突变或表达异常，其在肿瘤发生中的角色正日益受到关注[6-7]。有研究者认为miRNAs可作为癌基因或者抑癌基因而发挥作用[5-6]。因此miRNAs可能成为肿瘤诊断、治疗及判断预后的新的分子标志物和分子靶点，且由于miRNAs在转录后调节目的基因的表达，这将更有利于肿瘤的早发现、早诊断和早治疗，必将具有广泛的临床应用前景[8-9]。

骨肉瘤是起源于成骨组织的一种原发性恶性肿瘤，目前主要采用术前术后放疗联合外科手术的综合疗法。虽然化疗和手术治疗的水平不断提高，但仍然有大约一半的患者治疗失败，原因就在于肿瘤的早期转移以及耐药性的出现[1,8]。因此，迫切需要寻找新的肿瘤标志物来进一步提高骨肉瘤的早期诊疗水平。Murakami等[10-11]首次研究发现miR-93在肝癌组织中呈过高表达，最近又有研究发现miR-93通过调控integrin-β8而参调节肿瘤的生长[12]，但miR-93在骨肉瘤中的表达及其作用目前还不清楚。

笔者首先通过分析38例骨肉瘤组织及对应的软骨组织中miR-93的表达，发现65.8%的骨肉瘤患者癌组织中miR-93表达上调。将miR-93过表达载体转染入骨肉瘤细胞中，发现其表达明显增高。Krützfeldt等[13]研究发现针对 miRNA122及miRNA192的反义寡核苷酸能够明显抑制小鼠不同组织中对应miRNAs的表达，表明针对miRNAs的反义寡核苷酸可以有效抑制miRNAs的表达。本研究同样利用反义技术成功降低骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63内的miR-93表达。同时笔者利用MTT法检测证实miR-93可以抑制骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63的增殖。流式细胞术分析发现增加miR-93表达后骨肉瘤细胞G0/G1期降低，阻滞于S期；降低miR-93表达后骨肉瘤细胞周期主要停滞在 G0/G1期，而S期和G2/M期细胞的比例明显下降。另外在胃癌中的研究发现miR-93、miR-106b和miR-25等通过调控细胞周期而影响细胞生长[14]，这与本研究在骨肉瘤中的研究结果类似。

综上所述，miR-93在骨肉瘤的发生发展中发挥重要作用，很可能成为一个新的骨肉瘤形成前的标志物，为骨肉瘤基因治疗提供新的靶点。

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