水蛭素对动脉内皮保护作用的实验研究*

梁桂文 姜敏辉

水蛭是调节血脂、破血逐瘀的传统中药，其抗凝作用已经受到普遍认可。近年来有实验研究显示，小剂量水蛭具有保护血管内皮，促进内皮细胞生长的作用[1-2]。目前阿托伐他汀保护内皮作用已得到共识[3]。本研究旨在评价水蛭在动脉粥样硬化形成过程中对动脉内皮的保护作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 普通级健康雄性日本大耳白兔55只，体质量（2.4±0.2）kg，购于南通大学实验动物中心。水蛭购自南通大学附属医院中药房（过400目筛），阿托伐他汀由辉瑞公司馈赠，药物送饲料厂加工入饲料给药。饲料购自苏州双狮实验动物饲料科技有限公司。NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所（硝酸还原法），内皮素（ET）-1、前列环素（PG）F-1-α、血栓烷（TX）B2及 C反应蛋白（CRP）试剂盒购自上海沪峰化工有限公司。

1.2 方法 随机选取7只为正常对照（A）组，予以普通饲料120 g/d喂养，模型组48只予以高脂饲料（1%胆固醇、5%蛋黄粉、5%猪油、89%基础饲料）120 g/d喂养。9周后全部进行血脂检测并在随机选取模型组3只做病理观察，确定模型建立成功后模型组随机抽取40只分为4组，每组10只，继续高脂饲料喂养，其中未处理组（B组）不加药物；低剂量水蛭组（C 组）加入水蛭粉剂量 0.5 g/（kg·d）；高剂量水蛭组（D 组）加入水蛭粉剂量 1.5 g/（kg·d）；阿托伐他汀组（E 组）加入阿托伐他汀用量2.5 mg/（kg·d）。A组全部保留并继续普通喂养。继续喂养8周后各组均出现少量死亡，饲料A、B、C、D、E组进行入实验的兔分别为6、6、8、8、7只，第 8周末，所有存活兔禁食12 h后采血5～8 mL，制备血清。模型制作成功标准参照文献[4]。NO、ET-1、PGF-1-α、TXB2 及 CRP 的测定方法参照试剂盒说明书操作。总胆固醇 （TC）、低密度脂蛋白（LDL）采用全自动生化分析仪测定。采血结束后，将所有大耳白兔处死，取胸主动脉段大体观察，采用LeicaQWin图像分析系统汇总出斑块面积并计算斑块占动脉内皮总面积的百分比，取病变最严重处石蜡切片。

1.3 统计学方法 采用Stata 7.0统计学软件对数据进行分析。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Scheffe法。计数资料采用Kruskal-Wallis秩和检验，组间多重比较采用Dunn法。用LeicaQWin图像分析系统进行图像处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胸主动脉大体标本观察 见图1。A组胸主动脉内膜粉白色，表面光滑，动脉管壁弹性良好，无一例有动脉粥样硬化斑块或脂质条纹；B组内膜表面粗糙，弥漫增厚，管壁弹性差，易于断裂，有明显的斑块形成，灰白色、大小不等、相连成片，平均斑块面积达内膜总面积的74%；C、D、E组平均斑块面积分别为45%、21%、20%。

2.2 胸主动脉组织形态学改变 A组血管内膜均正常，见图2-1。余各组均出现了轻、重度粥样斑块，见图2-2及图2-3，成功建立大耳白兔动脉粥样硬化模型。其中 B组 4例 （67%）、C组 4例（50%）、D 组 2例（25%）、E 组 1例（14%）可见典型粥样斑块病变。

2.3 各组血清学指标结果比较 各组TC、LDL及NO等差异均有统计学意义（P<0.01），其中D组与B组各项指标差异均有统计学意义 （P<0.001）；D组和C组 TC、LDL、ET-1及 PGF-1-α差异无统计学意义（P>0.05）；D组和E组除TC、LDL及ET-1差异有统计学意义外（P<0.05或P<0.01），其他各指标差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

Figure 1 Macroscopic observation of thoracic aorta in five groups图1 各组胸主动脉标本大体观察

Table 1 Comparison of serological detection index between four groups表1 各组血清学指标结果比较 （±s）

Table 1 Comparison of serological detection index between four groups表1 各组血清学指标结果比较 （±s）

*P < 0.05，**P < 0.01

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Figure 2 Thoracic aorta observed by optical microscope图2 胸主动脉光镜观察（HE染色×100）

3 讨论

本研究中大耳白兔动脉粥样硬化模型造模成功，提示高脂可损伤动脉内皮，并导致动脉粥样硬化发生，其可能在动脉粥样硬化发生发展过程中起重要作用[3]。C、D斑块面积低于B组，提示水蛭具有保护动脉内皮、延缓动脉粥样硬化进展的作用。研究发现，血脂中LDL被氧化后参与形成泡沫细胞，还可损伤内皮，促进单核细胞及中性粒细胞黏附，促进平滑肌细胞增生及血小板黏附聚集，加剧炎症反应等，是动脉粥样硬化发生发展的重要原因[3,5]。本研究中C、D组血清TC和LDL均低于B组，差异有统计学意义，提示水蛭具有调节脂质代谢、保护内皮及延缓动脉粥样硬化进程的作用。但D组的TC、LDL值均高于E组，差异亦有统计学意义，提示在调节TC和LDL方面水蛭与阿托伐他汀有一定差距。

前列环素（PG）I2和血栓烷（TX）A2在体外极不稳定，本研究中以测定其稳定的代谢产物PGF-1-α和TXB2代替，同时测定NO和ET-1，结果显示，C、D组与B组比较，PGF-1-α和NO升高，TXB2、ET-1降低，差异有统计学意义，提示在内皮细胞保护方面它们具有相似的作用。李慎贤等[6]研究认为，血管内皮功能损伤在可见斑块出现前很长时间已经形成，在内皮功能障碍时分泌的各项因子中以PGI2、NO降低和TXA2、ET-1升高最为显著，其中TXA2能促进血小板聚集，收缩血管，ET-1是强烈的血管收缩剂，同时可促进平滑肌细胞增殖，二者的升高可进一步加剧病变的进展，而PGI2和NO为两者的拮抗因子，对内皮细胞损伤起到一定的保护作用。

目前研究认为，CRP是炎症反应因子，参与内皮损伤的炎症反应过程，可加速动脉硬化；CRP表达水平高低可反应动脉硬化程度以及斑块的稳定性[7-8]。本研究中D组CRP低于B组，表明水蛭能显著降低血清中CRP水平。C、D组间CRP差异有统计学意义，而D组与E组比较差异无统计学意义，提示水蛭可抑制炎症反应，作用与阿托伐他汀相似，从而改善动脉粥样硬化。但水蛭保护动脉内皮的作用是否存在其他的作用机制尚待进一步深入研究。

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