Bax在14-3-3γ对抗脂多糖诱导的心肌细胞损伤中的作用*

刘丹尹东孙惦许旻何明

脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能激发过度的炎症反应，产生脓毒血症[1]。心脏是脓毒血症中最易受损的主要靶器官之一[2]，因此，为降低脓毒血症的病死率，减轻心脏功能损伤极为重要。本课题组前期在内毒素整体动物模型上观察到，内毒素血症时心肌14-3-3γ表达增加，提示14-3-3γ可能在内毒素所致的心肌损伤中发挥重要作用[3]。本研究拟构建pFLAG-14-3-3γ重组质粒，转染至原代培养乳鼠心肌细胞，旨在从细胞水平探讨其在心肌细胞损伤中的作用，并进一步检测凋亡的重要调节因子Bax的表达与分布，深入探讨14-3-3γ的保护机制。

1 材料与方法

1.1 受试药品与主要试剂 pFLAG-CMVTM-4质粒（Sigma公司），限制性内切酶 Eco RⅠ和 KpnⅠ（NEB），逆转录试剂盒、T4 DNA连接酶、凝胶回收试剂盒及无内毒素质粒提取试剂盒 （Promega 公司），14-3-3γ 抗体、Bax抗体、β-actin 抗体及相应二抗 （Santa Cruz），线粒体分离试剂盒 （Biovision公司），LipofectamineTM2000 （Invitrogen），MEM 培养基（GIBCO BRL公司产品），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），增强化学发光印迹试剂和硝酸纤维素膜（Amersham公司），胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素,丙烯酰胺、SDS，亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、EDTA和 DTT（Sigma公司产品），其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞的分离培养 参照文献[4]方法略加改进，以下操作均在超净台内进行。取出生1～3 d的SD乳鼠，开胸取出心脏，分离心室组织，经0.1%胰酶消化分离，用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后置CO2培养箱（5%CO2，37℃）培养2 h去除成纤维细胞，台盼蓝鉴别细胞存活率在90%以上者用于实验，然后按5×105/孔、1×104/孔分别接种于6孔培养板和96孔培养板内，CO2培养箱培养，隔天换培养液，前3 d加入终浓度为0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 （Brdu）抑制纤维细胞生长。培养4 d随机分组进行实验。

1.2.2 实验分组（1）对照（Control）组：未转染质粒及未经LPS处理组。（2）LPS组：加LPS至培养液中，终浓度为10 mg/L，孵育6 h。（3）pFLAG+LPS组：空载质粒pFLAG转染至心肌细胞中，24 h 后处理同 LPS 组。（4）pFLAG-14-3-3γ+LPS 组：重组质粒pFLAG-14-3-3γ转染至心肌细胞中，24 h后处理同LPS组。

1.2.3 14-3-3γ真核表达载体pFLAG-14-3-3γ的构建 取SD鼠心肌组织 50 mg，用 RT-PCR方法获取 14-3-3γ（GenBank D17447.1）的全长编码 cDNA，引物序列 上游：5′-AAGAATTCCCCCGCGAAGATG-3′， 下游：5′-TTAGGTACCTG GGGCCTTAGTTGTT-3′，分别在上、下游引物中引入 Eco RⅠ和KpnⅠ的酶切位点及保护性碱基。PCR扩增后的目的基因cDNA与质粒pFLAG-CMVTM-4用 Eco RⅠ和 KpnⅠ双酶切、T4连接酶连接。连接反应产物转化感受态细胞并用抗生素筛选。质粒提取后，行酶切鉴定和DNA测序。

1.2.4 pFLAG-14-3-3γ重组质粒转染及表达效率的检测 在转染前，PBS洗2次，除去抗生素，将 LipofectamineTM2000（μL）与 DNA（μL）以 2.0∶0.8 比例混合，加入到每孔细胞中，置于培养箱（5%CO2，37℃）中孵育。24h后裂解细胞，提取蛋白，Western blot检测心肌细胞14-3-3γ蛋白表达。以空载质粒载体pFLAG为对照。

1.2.5 细胞存活率检测 采用MTT比色法检测。胰酶消化后收集细胞，每组细胞以1×104/孔接种于96孔培养板中。细胞覆盖率达70%～80%后吸出培养基。每孔加入MTT溶液（5 g/L溶于PBS）20μL，37℃孵育4 h。吸弃孔内培养上清液，再每孔加DMSO 150μL振荡10 min，使蓝色结晶充分溶解。酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光密度（OD）值，以间接反映各组活细胞数。

1.2.6 生化检测 各组分别取孵育液200μL，美国Beckman生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸磷酸酶（CPK）活性。当心肌细胞受损时，LDH及CPK会释放至孵育液中，使得LDH及CPK值升高，故LDH、CPK值与心肌细胞损伤成正比。

1.2.7 细胞凋亡检测 收集各组细胞，在细胞悬液中加入10 μL Annexin V-FITC和5μL的PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入300μL Binding buffer，立即进行流式细胞仪检测。

1.2.8 Western blotting检测线粒体和胞浆中Bax蛋白水平 各组使用线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒，按操作说明书制备线粒体和胞浆蛋白。同等量蛋白质完成SDS-PAGE后，进行电转膜，再先后结合一抗和二抗，最后X线胶片曝光分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5软件进行分析，计量数据以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染 pFLAG-14-3-3γ对心肌细胞14-3-3γ蛋白表达的影响 pFLAG组的14-3-3γ蛋白表达与对照组相比无明显升高，pFLAG-14-3-3γ组的14-3-3γ蛋白表达高于对照组和pFLAG组 （P<0.001）。说明重组14-3-3γ的真核表达载体在原代乳鼠心肌细胞中能有效表达，见图1、表1。

Figure 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups图1 14-3-3γ蛋白在各组中的表达

Table 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups表1 14-3-3γ蛋白在各组中的表达 （n=6，±s）

Table 1 The expression of 14-3-3γprotein in different groups表1 14-3-3γ蛋白在各组中的表达 （n=6，±s）

**P<0.01

?

2.2 14-3-3γ基因转染对LPS损伤后细胞存活率的影响 LPS组与对照组比较细胞存活率明显降低（P<0.001）；而转染了pFLAG-14-3-3γ的心肌细胞能明显对抗随后LPS所致损伤，使细胞存活率明显升高（P<0.001），见表2。

Table 2 Comparison of cell viability,LDH,CPK and apoptotic rate between different groups表2 各组细胞存活率、LDH及CPK活性、细胞凋亡率比较 （n=6，±s）

Table 2 Comparison of cell viability,LDH,CPK and apoptotic rate between different groups表2 各组细胞存活率、LDH及CPK活性、细胞凋亡率比较 （n=6，±s）

**P<0.01；（1）∶（2）～（4），（2）∶（4），（3）∶（4）， 均 P<0.001，（2）∶（3）P>0.05

?

2.3 14-3-3γ基因转染对LPS损伤后LDH、CPK的影响 LPS处理使LDH及CPK较对照组明显升高（P<0.001），而转染了pFLAG-14-3-3γ的细胞再受到LPS损伤处理，LDH及 CPK较LPS组及pFLAG+LPS 组明显降低（P<0.001），见表2。

2.4 14-3-3γ基因转染对LPS损伤后细胞凋亡的影响 LPS处理使心肌细胞凋亡率较对照组明显增加（P<0.001），转染 pFLAG-14-3-3γ 的细胞能明显对抗LPS所致的损伤，与LPS损伤组相比细胞凋亡率明显减少（P<0.001），见表2、图2。

Figure 2 The cell apoptosis detected by flow cytometry in different groups图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

2.5 14-3-3γ基因转染对LPS损伤后Bax表达与分布的影响 对照组Bax主要分布在胞浆，当心肌细胞遭受LPS损伤时，Bax移位至线粒体，胞浆/线粒体（cyto-Bax/mito-Bax）比值较对照组明显减少（P<0.001）。转染 pFLAG-14-3-3γ 能明显对抗Bax向线粒体的移位，使cyto-Bax/mito-Bax比值较LPS组和 pFLAG+LPS组明显升高（P<0.001），见表3、图3。

Table 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups表3 各组中胞浆、线粒体Bax蛋白水平 （n=6，±s）

Table 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups表3 各组中胞浆、线粒体Bax蛋白水平 （n=6，±s）

**P<0.01

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Figure 3 Levels of Bax protein in cytoplasm and mitochondria in different groups图3 各组中胞浆、线粒体Bax蛋白水平

3 讨论

3.1 14-3-3蛋白的基本生理作用 14-3-3蛋白是存在于几乎所有生物体细胞中的一类重要蛋白质家族，共有 β、ε、γ、η、σ、τ、ζ7 个亚型。14-3-3 蛋白主要通过与配体蛋白的相互作用，参与细胞周期、细胞凋亡、紧张反应和信号转导调控[5]。其中14-3-3蛋白最常见的作用方式就是将其配体蛋白限制在某一特定部位，通常是在胞浆，使其无法到达功能部位发挥作用[6]。

3.2 pFLAG-14-3-3γ质粒对心肌LPS损伤的对抗作用 本课题组前期实验中发现，14-3-3γ在大鼠烧伤及内毒素损伤模型中心肌表达明显升高[3]，高度怀疑此蛋白可能在内毒素致心肌损伤过程中发挥重要作用。为验证此假说，并排除整体动物实验多因素干扰，笔者构建了pFLAG-14-3-3γ重组质粒，建立原代SD乳鼠心肌细胞LPS损伤模型，结果发现转染pFLAG-14-3-3γ后，心肌细胞能明显对抗随后发生的LPS损伤，使细胞存活率升高，细胞损伤减轻，表现为LDH、CPK活性下降，心肌细胞凋亡减少。

3.3 pFLAG-14-3-3γ抗心肌LPS损伤作用与抑制Bax线粒体移位有关 有文献报道，在神经细胞胞浆中14-3-3蛋白与Bcl-2家族中的Bax结合[7]。Bcl-2家族是在细胞凋亡过程中发挥关键性作用的一类蛋白质，主要是通过调节线粒体膜的通透性，影响线粒体的功能来完成对细胞凋亡的调控。Bax是Bcl-2家族中的促细胞凋亡蛋白成员，通常情况下，Bax蛋白一般存在于胞浆内，受到相关的凋亡信号刺激时，移位至线粒体，直接或间接地与线粒体通道蛋白相互作用，引起促凋亡因子细胞色素C等的释放[8]。为此，本实验检测了Bax蛋白在细胞浆与线粒体中的表达情况，结果发现当心肌细胞遭受LPS损伤时，Bax蛋白由胞浆向线粒体转移，而当转染pFLAG-14-3-3γ后，Bax蛋白的这种向线粒体迁移则明显抑制，说明在心肌细胞胞浆中14-3-3γ能抑制LPS诱导Bax向线粒体的转移，进而维持线粒体膜的稳定性，起到对抗LPS损伤的作用。

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