OCIL shRNA表达载体的构建及其对成骨细胞RANKL/OPG基因表达的调节*

王 君 郑 纺 王宝利

核因子κB受体活化因子配基（RANKL）与其靶信号受体核因子κB受体活化因子（RANK）及诱饵受体护骨素（OPG）是调控骨吸收最重要的细胞因子系统[1-2]，是其他多数骨吸收调控因子的媒介[3]。破骨细胞分化抑制因子 （osteoclast inhibitory lectin,OCIL）是近年来新克隆的Ⅱ类跨膜C型凝集素，其组织分布与RANKL/OPG系统相似[4-5]。体外研究表明OCIL直接抑制小鼠黏附性脾细胞向破骨细胞样细胞的分化，提示破骨细胞前体上可能存在着OCIL受体，OCIL可以直接作用于该受体而影响破骨细胞分化[4]。但本研究小组前期研究显示，OCIL的抗破骨细胞生成作用与其影响骨髓基质细胞/成骨细胞RANKL/OPG系统的表达有关[6]。本研究旨在探讨成骨细胞中OCIL基因表达下调后骨吸收相关基因OPG和RANKL mRNA表达水平的变化，以及其对破骨细胞生成的影响。

Table 1 shRNA coding sequences of rat OCIL mRNA表1 大鼠OCIL mRNA的shRNA寡核苷酸序列

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 大鼠UMR106细胞株为本室保存。小干扰表达载体pRNATU6.1/Neo（GenScript公司）。脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000、G418（美国 Invitrogen公司），MMLV逆转录酶 （Promega公司），SYBR誖Green Master Mix（TOYOBO 公司），TRI试剂（Molecular Research Center）。质粒高纯度提取试剂盒购自天根生物有限公司，甲状旁腺素（PTH）购自北京康肽生物技术公司，寡核苷酸合成和DNA序列分析由上海英骏生物技术公司完成。实时荧光PCR分析在罗氏LightCycler 2.0荧光定量PCR系统上进行。

1.2 方法

1.2.1 OCIL shRNA表达载体的构建与鉴定 使用GenScript公司网站提供的siRNA Target Finder和siRNA Construct Builder（http://www.genscript.com/rnai.html）软件设计针对大鼠OCIL mRNA的 233、914、1301位点的 3对siRNA编码序列，在序列两端加上限制性内切酶酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ的切割后末端及10 bp环状的发夹样结构序列，分别命名为N1、N2和N3，见表1。采用本研究前期方法[7]将N1、N2和N3的序列分别通过Bam HⅠ和HindⅢ位点克隆于pRNATU6.1/Neo载体。使用Eco RⅠ和Eco RⅤ双酶切及序列分析鉴定重组阳性克隆的正确性。将构建成功的OCIL特异性shRNA表达载体分别命名为pRNAT-N1、pRNAT-N2和pRNAT-N3。

1.2.2 shRNA表达载体干扰OCIL mRNA表达效果的鉴定 将对数生长期的UMR106细胞按2×105/孔接种至6孔板并随机分为4组，使用Lipofectamine 2000分别将0.8μg的 pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3和对照载体 pRNATU6.1/Neo/CTL（阴性对照转染组，该载体包含一段不编码任何大鼠基因mRNA的阴性对照序列）转染至各组细胞内。使用400 mg/L的G418筛选稳定表达各shRNA表达载体和pRNAT-U6.1/Neo/CTL的UMR106细胞株。采用TRI试剂提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA第1链，Real-time PCR检测OCIL和β-actin mRNA水平，以β-actin校对后的OCIL水平代表OCIL相对表达水平。以各重组载体组OCIL mRNA相对水平与对照载体组OCIL mRNA相对表达水平的比值来表示抑制率。筛选出对OCIL mRNA干扰效果最佳的shRNA表达载体，进行后续实验。

1.2.3 OCIL shRNA表达载体对UMR106细胞中OPG和RANKL mRNA表达的影响 将对OCIL mRNA干扰效果最佳的shRNA表达载体（pRNAT-N1组）和对照载体pRNATU6.1/Neo/CTL（control组）分别瞬时转染UMR106细胞，12和24 h后收获细胞，提取细胞总RNA，逆转录为cDNA第1链，Real-time PCR检测OPG和RANKL mRNA的表达。PCR引物序列，见表2。PCR 反应条件：（1）25 μL 反应体系。上、下游引物 10μmol/L 各 1μL，cDNA 模板 5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 12.5 μL，dd H2O 5.3 μL。（2）循环参数：95 ℃预变性 5 min，94 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s， 进行 40 个循环。采用相对定量法来评价目的基因mRNA的表达水平，管家基因β-actin被用来标准化样品。

1.2.4 OCIL基因敲减的成骨细胞对破骨细胞样细胞（osteoclast-like cell,OLC）生成的影响 按文献[8]所述方法分离大鼠骨髓细胞，稀释至5×106/mL，加入20μg/L的巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF），将细胞悬液加入96孔板，0.1 mL/孔。细胞分为3组，vehicle组加入PBS及前述control shRNA转染细胞24 h的条件培养基 （占总体积10%）；PTH组加入1×10-7mol/L PTH及control shRNA转染细胞24 h的条件培养基；shRNA组加入 1×10-7mol/L PTH及 OCIL shRNA转染细胞24 h的条件培养基 （PTH+OCIL shRNA），37℃，5%CO2培养。3 d后换液并维持药物浓度不变。每天观察OLC分化情况。第7天进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）染色，计数OLC个数。细胞核数目≥3的细胞认定为OLC。

1.3 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件完成。计量数据以±s表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t验。P＜0.05为差异有统计学意义。

Table 2 Real-time PCR primers表2 Real-time PCR引物

2 结果

2.1 OCIL特异性shRNA重组表达载体的酶切鉴定和DNA序列分析 随机抽取pRNAT-N1、pRNAT-N2和pRNAT-N3各3个重组阳性克隆分别行Eco RⅠ和Eco RⅤ双酶切鉴定和1.5%琼脂糖凝胶电泳，3者双酶切后得到的小片段长度均约370 bp，见图1。重组阳性克隆经序列测定证明插入序列正确。

2.2 3种shRNA重组表达载体干扰OCIL mRNA表达的效果鉴定 与阴性对照转染组比较，3种shRNA表达载体对OCIL mRNA的表达均有沉默作用，pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3 OCIL mRNA相对表达水平分别为0.36±0.08、0.72±0.12 及0.41±0.05，差异有统计学意义（F=23.24，P<0.05），各组两两比较显示，除pRNAT-N1和pRNAT-N3组（P=0.266）外，其他各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3对OCIL mRNA水平的抑制率分别为64%、28%和59%。

2.3 pRNAT-N1转染的UMR106细胞中OPG和RANKL mRNA的表达 pRNAT-N1组 12、24 h RANKL mRNA表达水平较control组均升高，而OPG mRNA的表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。pRNAT-N1 组 RANKL∶OPG 比值在 12 h和24 h分别为对照组的2.9倍和5.1倍，见表3。

Figure 1 Digestion of pRNAT-N1,pRNAT-N2 and pRNAT-N3 constructs图1 pRNAT-N1、pRNAT-N2、pRNAT-N3 的酶切鉴定

Table 3 The mRNA expression of RANKL and OPG in UMR106 cells transfected with pRNAT-N1表3 pRNAT-N1转染的UMR106细胞中RANKL和OPG mRNA的表达 （±s）

Table 3 The mRNA expression of RANKL and OPG in UMR106 cells transfected with pRNAT-N1表3 pRNAT-N1转染的UMR106细胞中RANKL和OPG mRNA的表达 （±s）

**P<0.01

?

2.4 OCIL基因敲减的成骨细胞对破骨细胞样细胞生成的影响 Vehicle组、PTH组及shRNA组OLC数分别为（1.83±0.75）个/孔、（49.67±6.77）个/孔及（65.50±7.34）个/孔，差异有统计学意义（F=197.108，P<0.05）。

3 讨论

OCIL是Zhou等[4]在小鼠成骨细胞中发现的基因，属于Ⅱ型跨膜C型凝集素，并且该研究认为OCIL可能是独立于RANKL/OPG系统外的、调节破骨细胞发育和骨吸收的又一条作用通路。笔者曾采用哺乳动物细胞表达重组OCIL的方法，证实重组OCIL显著抑制骨髓基质细胞RANKL表达而上调OPG表达，与其他多数骨吸收调节因子相似，OCIL也可通过影响RANKL/OPG系统表达而抑制破骨细胞分化[6]。Nakamura等[9]研究显示，成骨细胞上存在着OCIL的受体，OCIL可以通过成骨细胞之间的相互接触沟通调节彼此的分化和其他细胞生物行为。本研究pRNAT-N1组12、24 h的RANKL mRNA表达水平较control组均升高，而OPG mRNA表达水平均降低，差异有统计学意义，RANKL∶OPG比值变化显著，表明OCIL可以通过位于成骨细胞的受体而调节RANKL/OPG表达。

本研究中vehicle组、PTH组及shRNA组OLC生成差异有统计学意义，表明成骨细胞OCIL表达减低后对破骨细胞分化的支持作用加强。OCIL是一种跨膜糖蛋白，由于本研究采用的是OCIL shRNA转染的成骨细胞的条件培养基，它对破骨细胞的影响不是OCIL的直接作用，而与培养基中的RANKL/OPG相对表达改变有关，进一步提示在OCIL对破骨细胞分化的调节作用中有RANKL/OPG系统的参与。因此，OCIL可能通过直接和间接两种方式调节破骨细胞分化。本研究与相关研究结论不同[4,9]，原因可能为：（1）所采用的细胞体系不同。Zhou等[4]在研究重组OCIL功能时采用小鼠黏附性脾细胞进行诱导分化。由于这一培养体系中缺少成骨细胞，OPG的表达水平很低。Nakamura等[9]则在研究重组OCIL调节成骨细胞分化的研究中采用了使用并不广泛的KUSAO成骨细胞系。笔者前期在探讨OCIL生物活性时采用了小鼠骨髓细胞，它属于混合细胞体系，含有成骨细胞和破骨细胞等多种细胞前体[8]。本研究中笔者采用了较为常用的UMR106成骨细胞。（2）所采用的重组OCIL蛋白来源不同。文献[4,9]采用了产自原核细胞的重组OCIL，缺少糖基化等化学修饰，而本研究采用的OCIL蛋白来源于哺乳动物细胞中国仓鼠卵巢细胞，可能具备更完整的生物学活性。

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