巴豆不同给药方式对荷瘤小鼠的影响

李佳桓，林海红，杜钢军

（河南大学药学院 药物研究所，河南 开封475004）

癌毒，是引发恶性肿瘤的一个重要因素，其致病暴戾，毒陷邪深，非攻不克，故中医常采用以毒攻毒之法，选用药性剧烈的中药，以达到攻坚蚀疮、破瘀散结之目的［1］。巴豆为大戟科植物巴豆（Croton tiglium L.）的干燥成熟种子，其味辛，性热，大毒，归胃、大肠、肺经［2］。本实验制备不同的巴豆制品，采用Lewis肺癌皮下移植模型和4T1乳腺癌肺转移模型观察了巴豆不同给药方式对荷瘤小鼠的影响。

1 材料

1.1 动物及瘤株

C57BL／6小鼠及 BALB／c小鼠，雌性，18～22g，购自河南省实验动物中心；Lewis肺癌，本实验室C57BL／6小鼠在体传代保存；4T1乳腺癌，本实验室BALB／c小鼠在体传代保存。

1.2 药品与试剂

巴豆（购自开封同济堂，经中药学许文渊教授鉴定）；印度墨汁（北京笃信精细制剂厂）；L-肾上腺素（1mg／支，重庆迪康长江制药有限公司）；谷胱甘肽（GSH，北京欣经科生物试剂有限公司）；二硫对二硝基苯甲酸（DTNB，国药集团化学试剂有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP，国药集团化学试剂有限公司）；硫代巴比妥酸（TBA，国药集团化学试剂有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.3 巴豆霜及水煎液的制备

巴豆霜：称取巴豆20g，去皮，粗纸包裹，电热板上烘热，压榨去油，换纸后再烘再榨，反复数次，直至纸无油痕，药物呈松散粉末状，口服给药时以所需剂量加入淀粉糊制成所需混悬液。水煎液：称取巴豆20g，加水500mL煎煮2次，每次40min，合并2次煎煮液浓缩至200mL，过滤，4℃保存备用，口服给药时根据给药剂量用蒸馏水稀释。

1.4 仪器

ELX800UV型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；SB-3C-1A型洁净工作台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；TDL-50B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；JY1001型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；FA1004N型分析天平（上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂）；SK-1快速混匀器（常州国华电器有限公司）；85-2恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；游标卡尺。

2 方法

2.1 对小鼠Lewis肺癌皮下移植肿瘤的影响

取生长良好的lewis肺癌传代实体瘤组织，用组织匀浆器制备单细胞悬液，调细胞数5×106／mL，按0.2mL／只接种于小鼠右前肢腋部皮下。将30只接种肿瘤的小鼠随机分为3组，每组10只。对照组：蒸馏水0.4mL／只灌胃给药；巴豆霜组：巴豆霜混悬液50mg／kg灌胃给药；水煎液组：水煎液50mg／kg灌胃给药。1次／d，连续3周，每日监测小鼠体质量。肿瘤长出后隔日用游标卡尺测量肿瘤直径2次，计算肿瘤体积。治疗结束次日，将小鼠处死，剥离肿瘤、脾脏，称重，计算抑瘤率和脾脏指数。

肿瘤体积（mm3）＝肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度／2；抑瘤率＝（1－T／C）×100%；脾脏指数＝脾脏质量（mg）／体质量（g）。公式中：C为对照组平均瘤重（g）；T 为实验组平均瘤重（g）。

2.2 对小鼠4T1乳腺癌肺转移的影响

取生长良好的4T1乳腺癌传代实体瘤组织，用组织匀浆器制备单细胞悬液，调细胞数5×106／mL，按0.2mL／只接种于小鼠左侧第二乳房垫上。将30只接种肿瘤的小鼠，随机分为3组，每组10只。对照组：蒸馏水0.4mL／只灌胃给药；巴豆霜组：巴豆霜混悬液50mg／kg灌胃给药；水煎液组：水煎液50mg／kg灌胃给药。1次／d，连续3周，每日监测小鼠体质量。治疗结束次日，剥离肺脏，用10倍放大镜计数肺转移结节数。剥离脾脏，称重，计算脾脏指数。

2.3 对荷4T1乳腺癌小鼠碳粒廓清能力的影响

肿瘤接种、分组给药方法同4T1乳腺癌模型。每日测小鼠体质量，治疗结束次日，从小鼠眶静脉采血20μL，吹入体积分数0.1%NaHCO32mL中，以等容量小鼠正常血溶于体积分数0.1%NaHCO3 2mL作为空白对照，用ELX 800型酶标仪630nm处测吸光度（A），计算廓清指数K及吞噬系数α。

廓清指数K＝（logA1－logA2）／（T2－T1）；吞噬分别为1min和10min吸光度，T1、T2分别为1min、10min。

2.4 对荷瘤小鼠体内抗氧化酶及脂质过氧化产物形成的影响

2.4.1 血清中SOD的测定 采用肾上腺素法，原理是肾上腺素在碱性溶液中自氧化产生的肾上腺素红在480nm有吸收峰，SOD能抑制肾上腺素自氧化，肾上腺素自氧化减少的程度代表SOD酶的活性。

2.4.2 血清中GSH-PX的测定 采用DTNB法，原理是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）可以促进H2O2与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成水及氧化型谷胱甘肽（GSSG），而GSH可以和二硫代二硝基苯甲酸（显色剂DTNB）作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子，呈现较稳定的黄色，在412nm有最大吸收峰，以GSH消耗程度代表GSH-PX酶活性。

2.4.3 血清中H2O2的测定 在辣根过氧化物酶（HRP）存在下，酚红被过氧化氢氧化后颜色由红变黄，当pH升至12.5左右时，黄色变为紫红色，可保持较长时间不变，于490nm测OD值。

2.4.4 血清中MDA的测定 采用TBA法，原理是过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。

2.5 统计方法

用SPSS 11.0软件进行分析。计量资料采用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，P＜0.05，有统计学意义。

3 结果

3.1 对小鼠Lewis肺癌皮下移植肿瘤及免疫器官的影响

巴豆霜灌胃有抑制肿瘤生长的作用，巴豆水煎液口服给药对肿瘤生长的抑制作用不明显；与对照组比较，巴豆霜灌胃组脾脏指数增加明显，巴豆水煎液组有增加趋势。整个实验过程小鼠生长状态良好，见表1。

3.2 对小鼠4T1乳腺癌肺转移及免疫器官的影响

与对照组相比，巴豆霜和巴豆水煎液灌胃能明显减少肺转移率和转移结节数，对脾脏指数无显著影响。整个实验过程小鼠生长状态良好，见表2。

3.3 对荷4T1乳腺癌小鼠碳粒廓清能力的影响

与对照组比较，巴豆霜组降低荷瘤小鼠碳粒廓清能力，巴豆水煎液组对荷瘤小鼠碳粒廓清能力有降低趋势，二者都有增加肝脏指数趋势，见表3。

3.4 对荷瘤小鼠体内抗氧化酶及脂质过氧化产物形成的影响

巴豆霜和巴豆水煎液对荷Lewis肺癌小鼠有增强SOD及GSH-PX酶活性作用，虽然2种治疗方式均引起MDA增加，但对H2O2水平无影响，见表4。在对荷4T1乳腺癌小鼠中，巴豆霜和巴豆水煎液抑制SOD和GSH-PX酶活性，不显著影响 MDA和H2O2水平，见表5。

表1 巴豆对小鼠Lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响（¯x±s，n＝10）

表2 巴豆对小鼠4T1乳腺癌肺转移的影响（¯x±s，n＝10）

表3 巴豆对荷4T1乳腺癌小鼠碳粒廓清的影响（¯x±s，n＝10）

表4 巴豆对荷Lewis肺癌小鼠抗氧化酶的影响（¯x±s，n＝10）

表5 巴豆对荷4T1乳腺癌小鼠抗氧化酶的影响（¯x±s，n＝10）

4 讨论

民间早已用巴豆治疗肿瘤，其提取物对甲状腺癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤具有治疗作用［3］。巴豆能缓解晚期胃癌患者症状，使病程进展缓慢，病灶明显缩小后，癌细胞能转化为正常细胞［4］。Morales等［5］发现巴豆中的二萜成分可诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡。本次实验结果显示，巴豆霜灌胃给药抑制实体瘤生长，同浓度巴豆水煎液口服作用不明显，但二者都能抑制肿瘤转移，证明巴豆有抗肿瘤作用，其抗肿瘤活性与药物处理方式有关。

脾脏是人体最大的外周免疫器官，在机体防御系统中，尤其在抗肿瘤免疫方面占有十分重要的地位［6］。巴豆霜或巴豆水煎液灌胃给药均可增加脾脏指数，巴豆中可能含有刺激脾脏细胞增殖的成分，但二者均有降低荷瘤小鼠碳粒廓清能力的作用或趋势，表明巴豆的免疫调节与其抗肿瘤活性没有必然的联系。实验中巴豆霜和巴豆水煎液对荷Lewis肺癌小鼠有增强SOD及GSH-PX酶活性作用，对荷4T1乳腺癌小鼠中却抑制SOD和GSH-PX酶活性，提示巴豆的调节机体抗氧化功能作用也与其抗肿瘤活性无关。巴豆中的抗肿瘤成分和抗肿瘤机制需进一步研究。

［1］查道成，吴立明.论药毒与癌毒［J］.陕西中医，2004，25（3）：267－269.

［2］万莉，周振海.巴豆的药理研究进展［J］.江苏中医药，2003，24（17）：60－61.

［3］徐春，汤德元，曾智勇，等.浅谈大黄和巴豆的药理作用研究［J］.世界农业，2007，343（11）：52－55.

［4］许冬青，王明艳，瞿融.巴豆生物碱对人胃腺癌细胞SGC-7901Fas基因表达影响的研究［J］.中医药学报，2005，33（2）：9－10.

［5］Morales A，Perez P，Mendoza R.Cytotoxic and proapoptotic activity of ent-16β-17α-dihydroxykaurane on human mammary carcinoma cell line MCF-7［J］.Cancer Lett，2005，218（1）：109－116.

［6］姜从桥.如何看待脾脏的抗肿瘤功能［J］.中华普通外科学文献，2008，2（6）：444－445.