东海原甲藻对尿素的吸收动力学与利用特性

徐 宁，秦俊莲，孙树刚，段舜山

暨南大学水生生物研究中心，广州510632

有害藻华与富营养化关系的研究是国际上近海海洋生态学研究的热点.近年来，沿岸海域的有机污染程度不断加重，溶解有机氮 (dissolved organic nitrogen，DON)，尤其是尿素 (CO(NH2)2)的含量快速增长［1-3］.同时，赤潮灾害也呈现出频率和类型增多、分布区域和规模扩大、危害日趋严重的演变趋势.研究显示，某些赤潮藻类能够利用尿素和一些溶解氨基酸［4］;海水中DON浓度的上升与赤潮频率的增加密切相关［5-6］.

东海原甲藻是近年引发中国沿海频繁赤潮的原因种之一［7］，严重危害了渔业生产、公众健康和近海环境［8-10］.研究显示，发生赤潮的长江口及邻近海域受人类活动的影响，营养盐含量很高［11］.然而，迄今为止，DON在东海原甲藻赤潮生长、消亡过程中的作用仍不清楚.本研究比较了东海原甲藻对尿素和无机氮源的吸收动力学和生长特性，以期为阐明赤潮藻对重要DON组分的利用策略提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验藻种为中国沿海典型赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)，采自我国东海赤潮高发海区，经毛细管分离培养成单细胞株系.

1.2 培养条件

试验藻种于LRH-400-G室内光照培养箱中培养，温度 (23±1)℃，辐照强度约25 W/m2，光暗比12∶12.选用f/2培养基，基础介质为人工海水(盐度为30.5‰).

1.3 东海原甲藻在不同N源下的生长动力学特征

分别以CO(NH2)2或NaNO3为N源经3轮或以上预培养.具体方法为:将指数生长期的藻细胞分别接种至N质量浓度为500 μg/L的CO(NH2)2或NaNO3培养基中，另添加NaH2PO4，使P的质量浓度为100 μg/L，其他组分同f/2培养基.至培养基中检测不出 N，分别接种至不同 N浓度 (0 μmol/L、1.764 μmol/L、4.410 μmol/L、8.820 μmol/L、44.100 μmol/L、88.200 μmol/L、441 μmol/L、882 μmol/L 和 8 820 μmol/L) 的 CO(NH2)2或NaNO3培养基中 (其他组分同f/2培养基)，置于室内同一光照培养箱中培养，每一处理设3个平行.每隔24 h取藻液5 mL观察计数并测定其光密度值OD680，采用Guillard的计算方法确定比生长率 μ (单位为 d－1)［12］.

1.4 东海原甲藻对尿素的吸收动力学特征

分别以CO(NH2)2或NH4Cl为N源经过3轮或以上预培养.具体方法同上.

时间序列实验.将经过预培养的藻细胞分别接种于3个1 000 mL三角瓶中，密度1 000/mL，终体积为600 mL，分别添加CO(NH2)2或NH4Cl溶液，使N的浓度为6 μmol/L.充分混匀后，立即抽取10 mL藻液，经孔径为0.7 μm的GF/F玻璃纤维滤纸过滤 (Whatman)，将滤液收集到20 mL聚乙烯瓶中冷冻保存;同样，分别于2 min、5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、60 min、90 min和120 min时抽取并过滤藻液，冷冻保存.用AA3连续流动化学元素分析仪 (Bran Luebbe)测定滤液中N浓度.

浓度序列实验.将经过预培养的东海原甲藻分别接种于3个1 000 mL三角瓶中，密度为1 000/mL，终体积为400 mL，然后按每瓶50 mL藻液分装至100 mL的三角瓶中.加入 CO(NH2)2或NH4Cl溶液，使 N浓度依次为:0 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、2.0 μmol/L、4.0 μmol/L、8.0 μmol/L、12.0 μmol/L 和 18.0 μmol/L，2 min时用孔径为0.7 μm的 GF/F玻璃纤维滤纸过滤(Whatman抽取10 mL藻液)，滤液冷冻保存，每种处理设3个平行.用同样方法测定N浓度.

1.5 数据分析

用SPSS17.0软件进行数据统计分析，t检验比较各处理之间的差异显著性.

利用Monod方程描述东海原甲藻比生长率与N浓度间的关系其中，μ为比生长率 (单位d－1);μm为最大比生长率 (单位d－1);c(N)为培养液中 N浓度 (单位μmol/L);K为半饱和常数 (单位μmol/L).

将方程(1)整理成c(N)/μ =K/μm+c(N)/μm.利用最小二乘法求出方程的斜率(1/μm)和截距(K/μm)，斜率的倒数与截距的乘积即为半饱和常数K.

利用经修改的Michaelis-Menten方程描述东海原甲藻对N的吸收速率与培养液中N浓度间的关系

其中，V为吸收速率 (单位h－1);Vm为最大吸收速率.同样，利用最小二乘法求出半饱和常数K.

2 结果与分析

2.1 东海原甲藻对尿素N和硝态N的利用特征

图1为不同浓度尿素N下东海原甲藻生长情况.结果显示，尿素N能较好地被东海原甲藻利用，且其浓度与东海原甲藻生长速率呈明显正相关.c(N)分别为441 μmol/L和882 μmol/L时，实验组东海原甲藻生长速率显著大于其他组(P＜0.05);c(N)=8 820 μmol/L时，实验组生长速率和最大细胞密度显著低于c(N)为882 μmol/L和441 μmol/L组(P＜0.05)，表明过高N浓度抑制东海原甲藻生长.当尿素N的浓度低于8.820 μmol/L时，东海原甲藻种群生长缓慢.

图1 不同浓度尿素N下东海原甲藻的生长曲线Fig.1 Effect of urea concentration on the growth of P.donghaiense

如图2，将东海原甲藻的μm和尿素N浓度拟合Monod方程，得双曲线方程μ=0.685c(N)/［20.508+c(N)］，R2=0.866 33.由此可知，东海原甲藻种群最大比生长速率为0.685/d，半饱和尿素N的浓度为20.508 μmol/L.

由图3可见，NaNO3能较好地被东海原甲藻利用，且其浓度与藻细胞生长速率呈明显正相关.c(N)=8 820 μmol/L时，实验组藻细胞生长最好;其次是c(N)=882 μmol/L组;再次是c(N)=441 μmol/L组 (P ＜ 0.05).c(N)为 88.200 μmol/L 和44.100 μmol/L时，实验组藻细胞生长速率均明显降低(P＜0.05).N浓度低于8.820 μmol/L时，实验组藻细胞生长缓慢.但c(N)=8 820 μmol/L时，东海原甲藻并未像尿素一样出现抑制生长现象.

如图4，将指数生长期的东海原甲藻 μ和c(NaNO3)拟合Monod方程，得双曲线方程μ=0.663c(N)/［11.940+c(N)］，R2=0.896 70.由此可知，东海原甲藻种群的μm为0.663/d，此时半饱和NaNO3浓度为11.940 μmol/L.相对而言，东海原甲藻在CO(NH2)2下的μm较高，而K略低，可见东海原甲藻能有效利用CO(NH2)2，并在N源充足时，可获得更高的繁殖速率.

图2 东海原甲藻在尿素N下的生长动力学曲线Fig.2 Specific growth rates of P.donghaiense as a function of urea concentrations

图3 不同浓度硝态氮下东海原甲藻的生长曲线Fig.3 Effect of nitrate concentration on the growth of P.donghaiense

2.2 东海原甲藻对尿素N和氨态N的吸收动力学特征

时间变化特征.图5显示，向N已耗尽的东海原甲藻培养液中一次添加CO(NH2)2或NH4Cl，使N浓度为6 μmol/L时，随时间延长，培养液中N浓度和藻细胞对N的吸收速率均迅速衰减.向培养液中添加CO(NH2)210 min后，其浓度降低至原来的60%;30 min时，其浓度继续降低，至原来的40%;60 min时，其浓度的下降趋势不明显.向培养液中添加NH4Cl 10 min后，其浓度降低到原来的45%;20 min时，浓度继续降低，至原来的40%;30 min时，其浓度继续下降，低至原来的30%;60 min时，其浓度下降变得不明显.可见，处于N耗尽状态的藻细胞对水体中N的输入非常敏感，可在第一时间迅速吸收并储存N源.然而，快速吸收期非常短，仅维持约30 min;60 min后吸收速率已衰减85%，且吸收缓慢.对比两者表明，向处于N耗尽状态的东海原甲藻培养液中一次性添加CO(NH2)2或NH4Cl，使N浓度为6 μmol/L时，东海原甲藻对氨态N的吸收速率高于对尿素N的吸收速率.

图4 东海原甲藻硝态N下的生长动力学曲线Fig.4 Specific growth rates of P.donghaiense as a function of nitrate concentrations

图5 东海原甲藻培养基中N浓度随时间的变化Fig.5 Changes of urea and ammonium concentrations in P.donghaiense medium over time

浓度响应特征.图6和图7显示，向N耗尽的培养液中一次添加不同浓度的CO(NH2)2或NH4Cl，添加2 min后，东海原甲藻对N的吸收速率与N浓度呈正相关.将东海原甲藻对尿素N或氨态N的吸收速率与其相应浓度拟合Michaelis-Menten方程，得双曲线方程

由此可知，2 min时东海原甲藻对尿素N的最大吸收速率为 3.184/h，半饱和 N浓度为 39.043 μmol/L(见表1和图6);对氨态N的最大吸收速率为 2.800/h，此时半饱和 N浓度为 18.032 μmol/L(见表1和图7).

表1 东海原甲藻对CO(NH2)2和NH4Cl的吸收动力学参数Table 1 Uptake kinetics of P.donghaiense for urea and ammonium

图6 东海原甲藻在不同浓度尿素N下的吸收速率Fig.6 Uptake rates of P.donghaiense as a function of urea

研究表明，东海原甲藻能有效利用CO(NH2)2和NH4Cl两种N源.相对而言，对NH4+的亲和力较高，表现为较低的半饱和常数K和较高的竞争系数α，在低N浓度下具有较高的吸收速率;对尿素的最大吸收速率较高，表现为随着N浓度的增加吸收速率持续增大.根据拟合方程 (3)和方程 (4)的结果，随着N浓度增加，东海原甲藻对尿素N的吸收速率会超过铵N，主要原因可能是高浓度NH4+对藻类具有毒害作用.

图7 东海原甲藻在不同浓度氨态N下的吸收速率Fig.7 Uptake rates of P.donghaiense as a function of ammonium concentrations

3 讨论

3.1 赤潮藻具备高效利用尿素的能力

本研究比较了东海原甲藻对 CO(NH2)2和NO3－的利用特征，结果表明，东海原甲藻能有效利用尿素，相对于无机氮，在尿素条件下的比生长速率更高.有研究证实，某些赤潮藻类能优先利用尿素.如Fan等［13］研究发现，美国切萨皮克湾的微小原甲藻(Prorocentrum minimum)即使在高NO3－浓度条件下，也会优先选择尿素.类似地，在低光条件下，3株Karenia brevis中2株对尿素氮的最大吸收速率高于氨态N和硝态N，且同化为蛋白质的比例均以尿素氮最高［14］;Li等［15］发现Karenia mikimotoi也能优先利用尿素.

本研究发现，当尿素N浓度达8 820 μmol/L时会抑制东海原甲藻生长，而同浓度硝态N却没有此现象.研究表明，大多数细菌中存在三磷酸腺苷脲酰胺酶，能将尿素分解为氨和碳酸氢根［3］.由于本研究使用的是未经无菌处理的藻株，培养基中的细菌降解尿素并释放出氨，过高浓度的氨可能对藻细胞直接产生毒害作用.另外，氨是脲酶活性的下行调节物［3，11］，可能抑制尿素转移酶和脲酶活性，这不利于藻细胞摄取和利用尿素.Jauzein等［16］发现NH4+强烈抑制 Alexandrium catenella对尿素的吸收.在野外观察中也发现，加入NH4+或环境中NH4+浓度增加，尿素的吸收速率会下降.如在切萨皮克湾，NH4+浓度为5 μmol/L时就会抑制尿素的吸收.

与NO3－相比，尿素是一种“节能型”N源.此外，赤潮藻在利用尿素N时，还能利用其中的碳源.这也可能是赤潮藻优先利用尿素的原因之一.然而，浮游植物利用尿素性能的多样性及其调控机制尚待深入研究.

3.2 浮游植物对尿素的吸收特征及生态学意义

研究结果显示，东海原甲藻对尿素N的吸收速率与对氨态N吸收速率接近 (见图6和图7)，表明尿素可能在赤潮生长消亡过程中起关键作用.近期的研究结果显示，许多赤潮种类对尿素具有很高的吸收速率.Collos等［17］在法国南部Thau泻湖爆发的4次藻华期间进行现场实验，比较了链状亚历山大藻对硝酸盐、亚硝酸盐、氨和尿素的吸收速率，发现氨和尿素是促进亚历山大链状藻生长的主要N源.另外有研究指出，在加州沿海形成赤潮的有毒藻Lingulodinium polyedrum和Cochlodinium fulvescens吸收尿素及其降解产物氨的速率远远超过对硝酸盐的吸收［10］.

营养组成对于刺激某些藻类的生长是十分重要的，一次突然的营养输入可能引起浮游植物种类组成和相对丰度发生逆转.例如，美国 Northport-Huntington湾的Alexandrium fundyense赤潮与污水排入密切相关［18］.进一步的研究显示，雨水和地表径流中携带的有机物促进了水华的发生［19］.在澳大利亚Moreton湾的现场研究发现，尿素占总N吸收的比例与甲藻所占比例高度相关.越来越多的文献表明，当环境中尿素成为常见N素形态时，甲藻数量可能会激增［11］.

随着沿海水域尿素浓度的不断上升，尿素在浮游植物群落演替和赤潮生长、消亡过程中的作用不容忽视.而对于浮游植物吸收、利用尿素的性能和调控机制的研究，将有助于深入了解有害藻华的形成机制.

结 语

综上研究可知:① 东海原甲藻能以尿素为唯一N源生长，其最大细胞密度与尿素浓度呈正相关，最大比生长率为 0.685/d，高于 NO3－的0.663/d.在N浓度为8 820 μmol/L时，尿素出现抑制生长的现象，而NO3－无此现象;② 东海原甲藻能有效吸收利用尿素和NH4+.相对而言，对尿素的最大吸收速率较高，而对NH4+的亲和力较高;③由于东海原甲藻具备有效吸收利用尿素的能力，水体中尿素含量的升高甚至会引发赤潮.

/References:

［1］ Glibert P M，ZHOU Ming-jiang，ZHU Ming-yuan，et al.Preface to the special issue on eutrophication and HABs:the GEOHAB approach ［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011，29(4):719-723.

［2］ Glibert P M，Allen J I，Bouwman L，et al.Modeling of HABs and eutrophication:status advances challenges［J］.Journal of Marine Systems，2010，83(3/4):262-275.

［3］ Bronk D，See J H，Bradley P，et al.DON as a source of bioavaiable nitrogen for phytoplankton ［J］.Biogeosciences，2007，4(3):283-296.

［4］ Mulholland M R，Lee C.Peptide hydrolysis and the uptake of dipeptides by phytoplankton ［J］.Limnology and Oceanography，2009，54(3):856-868.

［5］ WANG Zhi-hong，CUI Fu-yi.A comprehensive factor model of growth velocity of green algae and diatom in local lake area［J］.Journal of Shenzhen University Science and Engineering，2007，24(2):206-211.(in Chinese)王志红，崔福义.局部水域绿藻硅藻综合因子生长速率模型 ［J］.深圳大学学报理工版，2007，24(2):206-211.

［6］ HU Zhang-xi，Margaret R Mulholland，DUAN Shun-shan，et al.Effects of nitrogen supply and its composition on the growth of Prorocentrum donghaiense［J］.Harmful Algae，2012，13(1):72-82.

［7］ WANG Jin-hui，WU Jian-yong.Occurrence and potential risks of harmful algal blooms in the East China Sea ［J］.Science of the Total Environment，2009，407(13):4012-4021.

［8］ LI Ji，Patricia M Glibert，ZHOU Ming-jiang，et al.Relationships between nitrogen and phosphorus forms and ratios and the development of dinoflagellate blooms in the East China Sea ［J］.Marine Ecology Progress Series，2009，383:11-26.

［9］ XU Ning，SUN Shu-gang，DUAN Shun-shan，et al.Experimental study of urease activity in marine microalgae［J］.China Environmental Science，2010，30(5):689-693.(in Chinese)徐 宁，孙树刚，段舜山，等.海洋微藻脲酶活性测定方法的实验研究 ［J］.中国环境科学，2010，30(5):689-693.

［10］ ZHOU Ming-jiang，ZHU Ming-yuan.Progress of the project ecology and oceanography of harmful algal blooms in China ［J］.Advance in Earth Science，2006，21(7):673-679.(in Chinese)周名江，朱明远.“我国近海有害赤潮发生的生态学、海洋学机制及预测防治”研究进展［J］.地球科学进展，2006，21(7):673-679.

［11］ CHAI Chao，YU Zhi-ming，SONG Xiu-xian，et al.The status and characteristics of eutrophication in the Yangtze River(Changjiang)esruary and adiacent East China Sea［J］.Hydrobiologia，2006，563:313-328.

［12］ Guillard R R L.Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates［C］ //Smith W L，Chanley M H.Culture of Marine Invertebrate Animals.New York:Plenum Press，1975:29-60.

［13］ Fan C，Glibert P M，Alexander J，et al.Characterization of urease activity in three marine phytoplankton species，Aureococcus anophagefferens， Prorocentrum minimum，and Thalassiosira weissflogii［J］.Marine Biology，2003，142(5):949-958.

［14］ Sinclair G，Kamykowski D，Glibert P M.Growth，uptake，and assimilation of ammonium，nitrate，and urea by three strains of Karenia brevis grown under low light［J］.Harmful Algae，2009，8(5):770-780.

［15］ LI Ji，Patricia M Glibert，ZHOU Ming-jiang.Temporal and spatial variability in nitrogen uptake kinetics during harmful dinoflagellate blooms in the East China Sea ［J］.Harmful Algae，2010，9(6):531-539.

［16］ Jauzein C，Loureiro S，Garces E，et al.Interactions between ammonium and urea uptake by five strains of Alexandrium catenella(Dinophyceae)in culture［J］.A-quatic Microbial Ecology，2008，53(3):271-280.

［17］ Collos Y，Vaquer A，Laabir M，et al.Contribution of several nitrogen sources to growth of Alexandrium catenella during blooms in Thau lagoon，Southern France ［J］.Harmful Algae，2007，6(6):781-789.

［18］ Hattenrath Theresa K，Anderson Donald M，Gobler Christopher J.The influence of anthropogenic nitrogen loading and meteorological conditions on the dynamics and toxicity of Alexandrium fundyense blooms in a New York(USA)estuary ［J］.Harmful Algae，2010，9(4):402-412.

［19］ GU Yang-guang，WANG Zhao-hui，LU Song-hui.et al.Distribution of biogenic elements and potential contamination assessment in surface sediments from western Guangdong coasts［J］.Journal of Shenzhen University Science and Engineering，2010，27(3):347-353.(in Chinese)谷阳光，王朝晖，吕颂辉，等.粤西海域表层沉积物生源要素分布与污染评价 ［J］.深圳大学学报理工版，2010，27(3):347-353.