猪圆环病毒2型北京株的分离及基因组序列分析

吴惠明，郑瑞峰，郭 峰，靳兴军，傅彩霞，陈立本，韩 磊，杜 鹃，王玉田，李 佳

（北京市兽医实验诊断所，北京 朝阳100101）

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征，猪呼吸道综合征，繁殖障碍，肉芽肿性肠炎，坏死性淋巴腺炎，渗出性皮炎，先天性震颤等疾病也证实与PCV2感染有关［1］。

近年来，对PCV2遗传变异情况的报道不断增多。PCV2b基因型已取代PCV2a成为当前的优势基因型毒株［2］；PCV2基因组多为1 767nt或1 768 nt，而近年来有文献相继报道了基因组为1 766nt的新毒株［3－5］。为了了解当前北京地区感染猪群中PCV2的基因变异情况，为PCV2的分子流行病学、感染及预防控制提供参考，本研究对2010年北京地区的PCV2PCR检测核酸阳性的病料进行PCV2分离鉴定，并与GenBank登录的序列进行了同源性比较、构建了系统进化树，确定了分离毒株的基因型。

1 材料与方法

1.1 试剂及细胞株 ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL－2 000DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；PCV1和PCV2PCR检测试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；PCV阴性PK15细胞为农业部兽医诊断中心惠赠；DMEM、新生牛血清，购自Hyclone公司；D－Glucosamine、辣根过氧化物酶葡萄球菌A蛋白标记物、AEC购自Sigma公司；特异性抗PCV2抗血清，购自VMRD公司。

1.2 病料及PCR检测 病料采自2010年北京平谷等地规模化猪场具有PMWS临床症状的病猪的淋巴结、肺脏和脾脏组织。病料按照PCV1和PCV2PCR检测试剂盒说明书进行检测。

1.3 病毒的分离及鉴定 取PCR检测为PCV1阴性且PCV2阳性的组织病料样品，按1∶10（W／V）加入DMEM培养液，将组织研磨后，冻融3次、离心取上清液，过滤除菌。通过用D－氨基葡萄糖处理PK15细胞促进PCV2繁殖和分离［6］。用IPMA方法对分离的病毒进行鉴定，IPMA操作方法参照文献［7］。

1.4 全基因组序列的测定与分析 参考文献［5］合成两条引物PCV2－F（5′－ATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTT－3′）和 PCV2（5′－GTGGATTGTTCTGTAGCATTCTTCCA－3′），提取病毒培养物 DNA，扩增全基因组序列。扩增条件为预变性94℃5min；94℃30s，62℃1min，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。将PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。用DNAStar软件包进行全基因组核苷酸同源性分析。用MEGA5进行PCV2ORF2序列比对，并使用Neighbor－Joining算法生成系统进化树。最后，根据PCV2ORF2序列之间的遗传距离假定阈值0.035为标准划分基因型［8－10］。

2 结果

2.1 PCR检测结果 采自北京平谷等地的2份病料样品中均扩增出为1 154bp的目的条带，表明PCV2检测为阳性，PCV1阴性。

2.2 病毒分离鉴定结果 将经处理的两份组织匀浆，同步接种到PK15细胞后72～120h，没有出现细胞病变，盲传4代。应用IPMA检测F5代病毒时，可见接种的两份分离毒株PK15细胞内出现特异性红棕色沉淀，而空白对照细胞内无红棕色沉淀，说明接种病毒的PK15细胞内有PCV2增殖，待检病毒为PCV2。两个毒株分别命名为BJ2010LC株和BJ2010PG株。图1为BJ2010LC株IPMA试验结果，图2为BJ2010PG株IPMA试验结果，图3为IPMA试验空白对照细胞。

图1 BJ2010LC株IPMA试验结果（200×）

2.3 全基因组序列分析 病毒培养物PCR扩增获得1 800bp左右目的条带。PCR产物测序显示，分离的2株PCV2全基因组序列均为1 767bp，已录入GenBank中，BJ2010LC株登录号为JQ002671，BJ2010PG株登录号为JQ002672。两株病毒ORF2长度均为705bp。BJ2010PG株ORF2有两个终止密码子，编码233个氨基酸；BJ2010LC株ORF2编码234个氨基酸。序列同源性比较表明，本研究分离的2个PCV2分离株与10个PCV2株间的同源性为94.2%～99.5%。参与比较的毒株中，3个毒株分别为PCV2aPCV2bPCV2c的参考毒株，6株分别为2004年至2009年分离至北京的PCV2毒株。其中，BJ2010PG毒株与AF005394（PCV2b参考毒株）和BJ0401同源性较高，分别为99.5% 和 99.3%。BJ2010LC 毒株与 BDH 和BJ0901b同源性较高，均为99%。本次分离获得的2个毒株之间的同源性为96.6%。

2.4 遗传进化树的构建和分离毒株基因分型 参考文献［8－10］，利用 MEGA5的 Neighbor－Joining法将所分离2株PCV2的ORF2序列分别与PCV2a PCV2bPCV2c基因型参考毒株进行比对和系统进化分析，结果见图4。由图4可知，上述毒株分为四个基因型，分别为 PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。分离毒株BJ2010LC株属于PCV2d基因型，BJ2010PG属于PCV2b基因型。

图4 PCV2ORF2基因序列构建的遗传进化树

3 讨论

对于PCV2基因型的划分和命名，不同的研究组织常使用不同的划分标准和名称［5，9，11］。针对这种情况，2008年欧盟PCVD联合会（www.pcvd.eu）推荐通过遗传进化分析的方法对PCV2进行基因型命名，将PCV2基因型命名为PCV2a、PCV2b、PCV2c，并且分别将GenBank中最早的报道的原型毒株AF055392和AF055394分别作为PCV2a和PCV2b参考株，将20世纪80年代只有在丹麦发现的PCV2EU148503作为PCV2c的参考株。该方法根据序列间遗传距离（p－distance）不同进行分类，对PCV2ORF2序列进行比对，划分不同PCV2基因型的遗传距离假定阈值设为0.035［8］。Ge X 等［10］依据此方法对我国2001至2010年的68株PCV2进行了分析，结果显示，这些毒株中无PCV2c，有PCV2a、PCV2b和PCV2d。其中PCV2d是依据该方法划分出来的又一新基因型。PCV2d基因型毒株的特点是CAP基因终止密码子发生突变，导致ORF2变为705nt［10］。

本研究分离得到两株PCV2，其中BJ2010LC株属于PCV2d基因型，BJ2010PG属于PCV2b基因型。Ge X 等［10］指出，北京地区存在PCV2a、PCV2b、PCV2d三种基因型毒株。PCV2b已成为我国优势基因型，而PCV2d在我国北京、河北、山东、江西等11个省市存在［10］。

ORF2是PCV2变异最大的一个开放阅读框，有四种长度，分别为696bp、702bp、705bp和708bp，分别编码231、233、234（或233）个氨基酸和235个氨基酸。ORF2基因是主要的结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白，多数PCV2毒株的ORF2为702 bp［10，12］。BJ2010PG 和 BJ2010LC 株 ORF2 长 度 为705bp。BJ2010PG有两个终止密码子，编码233个氨基酸；BJ2010LC株编码234个氨基酸。而ORF2长度的不同对其功能的影响还有待进一步研究。

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