18SrRNA序列差异在马梨形虫分类学中的应用

罗 金，刘光远，田占成，谢俊仁，沈 辉，田美媛

（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室，甘肃 兰州730046）

马泰勒虫（Theileriaequi）作为引起马梨形虫病重要的病原之一，对马属动物产业造成了很大的危害［1］。该病主要以发热、贫血、淋巴结肿大为主要临床症状，偶尔也有死亡案例的报道［2］。马泰勒虫的命名一直存在争议，这给马泰勒虫病的临床诊断和流行病学调查带来了诸多不便。梨形虫的鉴定与分类，主要分为传统分类学和分子分类学［3］。传统分类学依据病原形态、发病动物临床症状等条件进行分类。但由于病原形态的局限，生活史较难追踪，传播媒介多样性，种种弊端使传统分类学存在一定的局限［4］。随着分子技术的发展和高保守性基因的发现，分子分类学方法在物种的分类上应用越来越广。

本文通过对中国肇源株马梨形虫18SrRNA V4高变区核苷酸序列进行PCR扩增并对阳性质粒测序。建立系统发生树，分析进化关系，同源性分析马巴贝斯虫与泰勒虫及巴贝斯虫之间的亲缘关系，并以18SrRNA核苷酸一级结构为基础，揭示该基因在分类学上的本质。分析马巴贝斯虫的种属性特异性，从而为马巴贝斯虫的分类提供进一步的依据。

1 材料与方法

1.1 虫体及试验动物 本试验所用马梨形虫虫株均由中国农业科学院兰州兽医研究所虫种资源保藏课题组提供。6～12月龄的马匹，购自于无马梨形虫病报道的地区。试验开始前马匹被切除脾脏，并连续进行病原学检查，在无任何血液原虫感染时才能用于试验。

1.2 虫体基因组DNA提取及18SrRNA核苷酸V4高变区的扩增 液氮保存的含虫血液分别接种试验动物，当染虫率达到5%以上，静脉采血。取300μL虫血，利用Gentra公司的DNA提取试剂盒，提取基因组。参考马泰勒虫（DQ287951）和驽巴贝斯虫（FJ209026）18SrRNA基因序列进行比对分析后在其V4高变区设计特异性引物。Bc18SF 5′－GACTTAAACCCTCGCCAGA－3′，Bc18SR 5′－TATGGTTAGGACTACGACGGT－3′；Te18SF 5′－TTTGGGCTGTTTACAGTTGC－3′，Te18SR 5′－CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG－3′。PCR扩增体系为去离子水37.5μL，10×PCR Buffer（含 Mg2＋）5μL，2.5 mmol／L dNTP混合液4μL，上下游引物各1μL，虫体基因组DNA 1μL，rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL。退火温度56℃下进行PCR。并将克隆到pMD19－T载体上的PCR产物送北京三博远志生物科学技术有限公司进行测序。

1.3 序列比对和分析 测序所获得的序列与Gen－Bank中登录的不同梨形虫的18SrRNA V4高变区（数据未显示）进行分析。用DNAStar软件包中MegAlin对序列进行分析。Clustal W方法对序列进行对齐，构建系统发生树，并分析梨形虫种内及种间亲缘关系。通过泰勒虫与巴贝斯虫核苷酸序列一级结构特征，分析两虫种之间18SrRNA核苷酸序列的V4高变区的差异性。

2 结果

2.1 马梨形虫18SrRNA V4高变区扩增及序列分析 PCR产物所得到的马泰勒虫和驽巴贝斯虫18S rRNA V4高变区序列长度分别为531bp和452bp。将该序列与GenBank中公布的部分梨形虫18S rRNA核苷酸序列共同构建系统发生树。显示，泰勒虫种和巴贝斯虫种分属两大分支。在巴贝斯分支中，驽巴贝斯虫种分为一支，犬巴贝斯虫和分歧巴贝斯虫构成一支，二联巴贝斯虫作为单独一支存在。泰勒虫分支中存在两个主要的分支。羊泰勒虫和环形泰勒虫有着较近的亲缘关系，与中华泰勒虫处于同一分支。而我国肇源株马泰勒虫与马巴贝斯虫在同一分支如图1。

图1 基于18SrRNA基因的梨形虫系统进化树

2.2 同源性分析 Clustal W方法比对试验中所测梨形虫序列的同源性进行分析。结果显示，马泰勒虫（肇源株）和羊泰勒虫、中华泰勒虫、环形泰勒虫、马巴贝斯虫的同源性分别为91.8%、91.0%、91.0%、96.4%。在巴贝斯科中，其种内18SrRNA序列的同源性均高于93.0%，而驽巴贝斯（肇源株）虫与犬巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的同源性分别为93.3%、94.9%。

2.3 序列对齐分析 通过DNAStar软件中的MegAlin对所研究的序列进行对齐。显示梨形虫18SrRNA基因序列具有很高的保守性，仅V4高变区存在较大差异。值得注意的是巴贝斯虫与泰勒虫在一些区域存在较长片段的缺失，或者某个基因的 缺失或变异见图2。

图2 马泰勒虫及泰勒虫种和巴贝斯虫种18SrRNA对齐分析。补充及序列差距用O表示，核苷酸置换相关性用□表示

3 讨论

长期以来马泰勒虫的分类一直存在争议。以往的文献及教科书中都将其命名为马巴贝斯虫，认为马泰勒虫属于巴贝斯科、巴贝斯属。我国对马泰勒虫的分类研究主要建立于传统分类方法（包括病原的形态、致病性、传播媒介与传播方式、生活史等）基础上［5］。然而马梨形虫相似的形态结构，难以追踪的生活史使得马梨形虫的鉴定存在较大困难。分子生物学技术的发展使人们能够在分子水平上认识病原，18SrRNA基因已在物种分类领域得到广泛应用［6］。18SrRNA作为梨形虫最为保守的序列，在物种分类上具有重要意义。龚真莉（2010）［7］在我国首次利用ELISA方法对驽巴贝斯虫和马泰勒虫进行了鉴别，交叉反应试验特异性良好，从而区分了马梨形虫两个虫株的分类学特征。该方法虽能很好对马梨形虫分型，但对其正确命名没有阐述。Grandi G等［8］，通过间接荧光抗体技术和巢式 PCR（nPCR）方法对意大利北部地区的马梨形虫病情况进行了调查。Georges K C等［9］以18SrRNA为靶基因，应用反向线性印迹方法对马泰勒虫病的诊断方法进行了评估。以上方法不同程度的说明了当地马梨形虫病的流行情况。但是都不能很好的对马泰勒虫进行分类鉴定。Raksha Bhoora［10］以马泰勒虫表面裂殖子抗原基因（EMA1）为模板设计特异性引物，利用实时定量PCR对马泰勒虫的基因型进行了分析，从而得出马泰勒虫存在3个基因型的结论，但是至于泰勒虫的隶属于泰勒虫虫种还是巴贝斯虫种，作者并没有给出答案。罗金 等（2011）［11］利用Hsp70对我国马梨形虫在世界马属动物梨形虫中的分类学地位进行了阐述。从而为马巴贝斯虫隶属于泰勒虫种的泰勒虫科分类命名给出了证据。同年，罗金［12］利用18SrRNA基因再次对马泰勒虫的分类学特征进行了研究，得出的结论与上述一致。

18SrRNA基因序列作为物种分类鉴定重要的靶标序列，已经得到广大科研工作者的认可，但是其分类鉴定的本质是什么，还未曾报道。本试验选择马梨形虫18SrRNA基因序列的V4高变区设计引物，通过PCR技术获得该序列片段，并构建了系统发育进化树，同时对梨形虫之间的亲缘关系做了进一步的阐述，最终利用该序列的一级结构特征对泰勒虫和巴贝斯虫之间的分类进行了阐述，进一步佐证了马巴贝斯虫隶属于泰勒虫科，泰勒虫属。系统发生结果显示，泰勒虫和巴贝斯虫分为明显的两支。在巴贝斯虫的分支中，驽巴贝斯虫（肇源株）与美国株及西班牙株有较高的同源性，分别为98.4%、98.2%。马泰勒虫（肇源株）与西班牙虫株亲缘关系较近，其同源性为96.4%，而与南非株和苏丹株高达98.3%。值得注意的是之前被称为马巴贝斯虫的虫种和马泰勒虫种在同一分支上，同源性为96.4%。以上结果表明，18SrRNA这种高度的保守性，在物种的分类鉴定方面有着重要的应用价值。为进一步阐明18SrRNA在不同物种间的分类学本质。我们对不同梨形虫18SrRNA核苷酸序列进行对齐分析，结果显示，在其序列的V4高变区巴贝斯虫相对泰勒虫有部分片段的缺失，一些位点的突变也是造成泰勒虫和巴贝斯虫种间差异的主要原因。马巴贝斯虫18SrRNA核苷酸一级结构表明，其序列特征和泰勒虫科、泰勒虫属序列特征基本一致，而与巴贝斯虫存在较大差异。结合马泰勒虫和巴贝斯虫病原形态、致病性、传播方式等特点我们最终确定，马巴贝斯虫属于泰勒虫科，泰勒虫属。

［1］罗金，刘光远，田占成，等.马梨形虫病诊断技术的研究现状［J］.动物医学进展，2011，32（1）：99－104.

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［4］罗金，刘光远，谢俊仁，等.驽巴贝斯虫病PCR检测方法的建立和应用［J］.中国畜牧兽医，2011，38（7）：193－195.

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［10］Raksha Bhoora，Melvyn Quan，Matjila P T，etal.Sequence heterogeneity in the equi merozoite antigen gene（ema－1）ofTheileriaequiand development of an ema－1－specific TaqMan MGBTMassay for the detection of T.equi［J］.Veterinary Parasitology，2010，172：33－45.

［11］罗金，刘光远，田占成，等.基于Hsp70基因的马梨形虫分类学定位分析［J］.中国农业科学，2011，44（17）：3694－3700.

［12］罗金，刘光远，田占成，等.基于18Sr RNA基因序列的我国马梨形虫分类学地位分析［J］.动物分类学报，2011，36（1）：99－103.