四川道孚县牦牛梨形虫的分子检测及中药防治研究

李友英，蓝 岚，潘 瑶，杨丹娇，吴建平，张康林，汤 承

(1.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2.甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所，四川 康定 626000；3.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041)

0 引言

梨形虫病是反刍动物中一种重要的蜱传寄生虫病[1-2]。该病的临床表现多样，且多呈非特异性[3]，主要以贫血、黄疸、发烧、血红蛋白尿、消瘦等为主[4-7]。目前青藏高原地区，公开报道的会感染牦牛的梨形虫病病原主要有中华泰勒虫、吕氏泰勒虫、环形泰勒虫、东方泰勒虫等[8-10]。在已报道的牦牛泰勒虫病原中，环形泰勒虫对家畜的危害最为严重，其次是东方泰勒虫、中华泰勒虫等，吕氏泰勒虫其致病性较强，严重者可导致患畜死亡，被称为“恶性泰勒虫”[11-13]。道孚县位于四川西北部，甘孜东北部，整体养殖方式粗放，相关人员防治意识淡薄，牦牛梨形虫感染情况严重，给农牧民造成巨大的经济损失。蓝岚等[9]于2018年6-11月，对甘孜18个县(市)牦牛梨形虫的感染情况进行调查，采集牦牛全血1 381份，梨形虫平均阳性率为31.72%，其中道孚县为28.99%。目前未有对该县牦牛梨形虫流形特点的确切报道，因此对道孚县牦牛梨形虫流行特点的调查及防治措施的研究很有必要，对梨形虫病的早期防控具有重要意义。贝尼尔是目前常用的抗梨形虫药物[14-15]，疗效确切，但副作用较大，且易产生耐药性。中药有营养和药物的双重作用，且具有低残留、低耐药性的特点，是首选的绿色兽药产品[16-18]。本试验研究了贝尼尔结合中药方剂、青蒿、百部对牦牛梨形虫病的防治效果，为牦牛梨形虫病的防治提供新的途经和有效方法。

1 材料与方法

1.1 牦牛血样采集

2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月，自道孚县每月定点采集牦牛全血173份，标记时间、年龄、体重，装于一次性真空抗凝管置冰盒带回实验室检测。所有的血样均放在-20℃冰箱保存。

1.2 蜱虫采集

于2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月采集牦牛血样时，采集血样的牦牛体表如有蜱，采集后装入收集管，放入75%酒精溶液中，并置于4℃冰箱保存待检。

1.3 试验药物

贝尼尔(购于四川恒通动物制药有限公司，批号 20180901)，中药购自中药房。

1.4 牦牛梨形虫的分子检测

1.4.1 全血总 DNA 提取

采用酚-氯仿法提取牦牛全血总 DNA。

1.4.2 18S rRNA 引物的设计

采用以18S RNA为靶基因的梨形虫巢式 PCR 方法进行检测。引物信息为外上游引物:GATAACCGTGCTAATTGTAGG，外下游引物:ATCGTCTTCGATCCCCTAACT，扩增片段大小为 843 bp；内上游引物:AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG，内下游引物:GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC，扩增片段大小为 760 bp，靶基因 18SrRNA。

1.4.3 虫种鉴定

随机挑选部份牦牛梨形虫核酸阳性样本共计38份的PCR产物送生工(上海)测序。通过NCBI上的BLAST对序列进行比对；采用MEGA 7软件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值为1000)基于梨形虫序列构建系统进化树，运用Lasergene 7.0软件对所测得的序列进行同源性比对分析，根据构建的进化树及同源性分析结果鉴定梨形虫虫种。

1.5 媒介蜱的形态学鉴定

采用体式显微镜对蜱初步进行形态学鉴定。

1.6 中药防治研究

选择有梨形虫感染，年龄、体型相似的牦牛35头，随机分为5组，每组4～10头。药物组1:贝尼尔结合中药方剂，贝尼尔，3 mg/(kg体重)，临用前配成5%～7%溶液，肌注；中药方剂，秦艽散加减方:秦艽30 g、当归25 g、赤芍 25 g、瞿麦20 g、车前子20 g、焦栀子20 g、大黄20 g、茯苓 20 g、淡竹叶15 g、灯心草15 g、川楝子18 g、甘草20 g，500 mL/头，灌服，1次/d，连续给药3 d。同时进行体外灭蜱。药物组2:百部，25～30 g/头，粉为细末，拌料喂。同时进行体外灭蜱。药物组3:青蒿药液，60 g/头，灌服。同时进行体外灭蜱。阳性药物组:贝尼尔，肌注，3～5 mg/kg，临用前配成 5%～7% 溶液。同时进行体外灭蜱。空白组:进行体外灭蜱。用药前及用药后50 d，称重并采集牦牛血液进行血常规检测，对梨形虫病原进行检测，分析中药防治效果。

1.7 数据分析

2 结果

2.1 道孚县牦牛梨形虫整体感染情况

采集血样173份，经巢式PCR扩增其18S rRNA部分基因序列，其中有59份样本扩增出目的条带，梨形虫平均阳性率为34.10%。部分样本PCR电泳结果，如图1所示。

M—D2000 DNA Marker；2—阳性对照；1—阴性对照(去离子水)；3～13—牦牛全血样本

2.2 不同月份牦牛梨形虫的感染情况

定点对道孚县进行为期 6 个月的跟踪调查，发现各月份均有梨形虫感染，4月、5月、6月、7月、9月、10月平均阳性率分别为:28.00%(25/7)、66.67%(15/10)、51.02%(49/25)、34.62%(26/9)、14.63%(41/6)、11.76%(17/2)。5月、6 月牦牛梨形虫阳性率均显著高其高于其他月份(P<0.05)，之后成下降趋势，见图2，图2中所标字母相异(a～c)表示差异显著(P<0.05)。

图2 牦牛感染梨形虫的季节动态

2.3 不同年龄组牦牛梨形虫的感染情况

各个年龄段梨形虫阳性率也均不相同。犊牦牛组(0～2 岁)梨形虫平均阳性率为 34.48%(29/10)，青年牦牛组(2～5 岁)为 45.78%(83/38)，成年牦牛组(5 岁以上)为 18.03%(61/11)。由图3可知，青年组牦牛梨形虫阳性率最高，显著高于犊牦牛组和成年组(P<0.05)。成年组牦牛梨形虫阳性率最低，显著低于犊牦牛组和青年组(P<0.05)。表明青年组牦牛(2～5岁)最易感染牦牛梨形虫病。

图3 不同年龄组牦牛梨形虫的感染情况

2.4 不同体重牦牛梨形虫的感染情况

对感染梨形虫牦牛的体重进行分析。小于 100 kg、100～200 kg及大于 200 kg的牦牛梨形虫阳性率分别为:42.11%(95/40)、28.57(63/18)、6.67%(15/1)。小于 100 kg、100～200 kg 的牦牛梨形虫阳性率均显著高于 200 kg 以上的牦牛(P<0.05)，感染梨形虫的牦牛体重明显下降，如图4所示。

图4 不同体重牦牛梨形虫的感染情况

2.5 牦牛梨形虫虫种检测结果

从牦牛梨形虫阳性样本中挑选 38 份样本PCR产物测序鉴定虫种，鉴定虫种1个，均为中华泰勒虫。基于梨形虫18SrRNA基因序列建立进化树进行牦牛梨形虫虫种鉴定。由图5可见，中华泰勒虫大枝包括道孚检测出的中华泰勒虫虫株 38 株及Genback 中已发表的甘肃、河南分离株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)，其又分为两小枝，其中一支为检测出的中华泰勒虫虫株 33 株(Yak-32、6-7)与已发表的甘肃、河南分离株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)，另一支为检测出的其他中华泰勒虫虫株5株(5-2、6-13、6-4、5-1、5-3)。

将检测到的虫株在 MegAlign 软件上进行同源性比对分析，测出的中华泰勒虫之间的同源性为 94.20%～100.00%，与已发表的虫株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)之间的同源性为 94.50%～100.00%。

2.6 蜱虫形态学鉴定结果

共采集到蜱虫199 只，经形态学鉴定，均为微小扇头蜱，如图6所示。

Yak-32—中华泰勒虫32个样本序列；▲—其他样本序列；■—已发表的中华泰勒虫虫株

A—微小扇头蜱背面；B—微小扇头蜱腹面

2.7 中药防治效果观察

2.7.1 中药防治对牦牛梨形虫感染情况的影响

对用药前后牦牛梨形虫感染情况进行检测。由表1可知，空白组牦牛梨形虫阳性率为100%，各药物组梨形虫阳性率均呈下降趋势；药物组 1、2牦牛梨形虫阳性率与阳性药物组相比有所降低。

2.7.2 中药防治对牦牛体重的影响

对上述有梨形虫感染的35头牦牛进行防治，由表2可知，各药物组牦牛的体重均有增加，阳性药物组、药物组1、2、3 牦牛AG、ADG均比空白组高。药物组1、2牦牛AG、ADG显著高于阳性药物组和空白组(P<0.05)。药物组3牦牛AG高于阳性药物组和空白组，但差异不显著；ADG显著高于空白组(P<0.05)，较高于阳性药物组，差异不显著。

表1 中药防治对牦牛梨形虫感染情况的影响

表2 中药防治对牦牛体重的影响

2.7.3 中药防治对牦牛 RBC、HGB 的影响

用药前后对试验组35头牦牛血液进行血常规检测，用药前10头牦牛 RBC、HGB低于参考值。由表3可知，各用药组牦牛RBC、HGB均有升高，阳性药物组和药物组1、2、3牦牛RBC、HGB均达到参考值；空白组牦牛RBC未达到参考值，HGB达到参考值。

表3 中药防治对牦牛RBC、HGB的影响

3 讨论

近年来，陆续有关于青藏高原地区牦牛感染梨形虫的报道，但目前为止，对牦牛感染梨形虫规律的确切报道较少。本试验正是基于这一现状，2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月定点对道孚县牦牛进行为期6个月的跟踪调查，首次分析不同月份、年龄段及体重牦牛梨形虫的感染情况，为道孚县牦牛梨形虫病的防治提供依据。

18S rRNA具有保守性和高变性，还可对感染虫种进行鉴定，在梨形虫检测中广泛应用且效果良好[19，21]。本实验采用以18S rRNA 为靶基因的梨形虫巢式PCR方法，并通过构建系统进化树及同源性分析，对四川省道孚县牦牛梨形虫病原及虫种进行检测。

本次调查显示道孚县牦牛梨形虫阳性率为34.10%，道孚县平均海拔约3 245 m，为半农半牧业县，与纯牧业县相比，灌木丛较多，良好的自然环境及较高的生物多样性，为蜱虫提供了适宜的环境条件，增加了蜱侵袭牦牛，传播梨形虫病的概率。5-6月份为感染高峰期，梨形虫是一种由蜱传播的血液原虫病[20]，所以其感染率与蜱虫的活动规律密切相关。本实验将采集到的蜱虫进行形态学鉴定，均为微小扇头蜱。微小扇头蜱在我国分布广泛，主寄生于大家畜体表，如黄牛、牦牛、绵羊等[21]，主要生活在农区，气候温和，雨量充沛的季节蜱虫活跃度开始增高。呈季节消长性，一二月寄生数量不多，3月开始数量逐渐增多，直到6月达到最高峰，以后数量又逐渐减少，但终年都存在[22]。道孚县春夏不分明，冬长夏短，冬寒干燥，五六月份气温开始升高，降水量、植被增多，蜱虫开始活跃。本实验牦牛感染梨形虫的季节动态与微小扇头蜱活动季节趋于一致。本实验梨形虫青年组牦牛(2～5岁) 最易感染中华泰勒虫病，与刘道鑫等[23]不同年龄阶段牦牛泰勒虫病的调查结果:2～3岁牦牛最易感染泰勒虫病，趋于一致，应注意该年龄段牦牛梨形虫病的防控。本次检测显示优势虫种为中华泰勒虫，与蓝岚等[9]对四川甘孜进行的牦牛梨形虫感染情况调查结果:优势虫种为中华泰勒虫与吕氏泰勒虫；以及钟维等[10]对四川省阿坝州5个县进行的牦牛梨形虫检测结果:感染虫种均为中华泰勒虫，趋于一致。本次检测牦牛均未发现有明显的临床症状，说明中华泰勒虫为温和型泰勒虫[24]，裂殖体并不起主要作用。但是比较不同体重牦牛梨形虫的感染情况，结果显示，感染梨形虫的牦牛体重明显下降，除此之外对有梨形虫感染的 35 头牦牛进行血常规检测，10 头存在贫血现象。梨形病感染会导致牦牛生长发育迟缓、产肉量下降等[25-26]，大大降低了农牧民的经济收入，所以做好梨形虫病的防治工作对农牧民增收有重要的意义。

目前防治梨形虫病多采用贝尼尔、盐酸吖啶磺等，但其副作用大，病牛体质恢复较慢且均需肌肉或静脉注射，一般需要专业兽医人员进行操作，目前甘孜牧区保定设施及基层兽医人员缺乏，临床普及不易。中药副作用小，功效独特，诸多药物具有增强免疫力、抗菌驱虫、保健防病的作用[27-28]，对牦牛感染梨形虫后的体质有改善作用。且中药价格便宜，多采用拌料或灌服，农牧民自己即可操作，较易普及。栗明来等[29]用三氮眯结合中药方剂同时应用，取得确实的疗效。王守文等[30]对中西药治疗羊梨形虫病效果进行对比，三氮脒治愈率为 73.5%，采用中西药物结合治疗，疗效确实显著，治愈率达97.6%。国内报道运用中西药结合治疗梨形虫病的越来越多。秦艽散具有祛瘀止血，清热利尿的功能，主治膀胱积热，努伤尿血[31]，本实验减去秦艽散中黄芩、红花、蒲黄、大黄、白芍、天花粉，加上赤芍、连翘、茯苓、灯心草、川楝子等清热凉血、清热解毒、利水利尿、驱虫药物，组成具有清热利尿、祛瘀止血、补血和中、补气、驱虫、健脾生血、增强体质功效的中药方剂。将该方剂结合贝尼尔对牦牛梨形虫进行防治，用药后牦牛梨形虫阳性率下降，牦牛 AG、ADG 显著高于阳性药物组和空白组，且改善了牦牛的贫血现象，说明中西药结合防治牦牛梨形虫病可大大提高防治效果。百部具有杀虫的功效[31]，青蒿具有杀原虫、清热解毒的功效[31]。郑海等[32]研究了中药百部对羊泰勒焦虫病的防治效，发现其治疗效果优于贝尼尔，而预防效果相同。丁景昌等[33]采用用青篙对牛双芽巴贝斯焦虫病进行治疗，结果显示，其可直接杀灭双芽巴贝斯焦虫，属于高效抗双芽巴贝斯焦虫的药物。本实验分别采用百部及青蒿对牦牛梨形虫病进行防治，各药物组梨形虫阳性率均呈下降趋势。百部组牦牛梨形虫阳性率与阳性药物组相比有所降低，牦牛 AG、ADG 显著高于阳性药物组和空白组(P<0.05)。青蒿组牦牛 AG 高于阳性药物组和空白组，但差异不显著；ADG 显著高于空白组(P<0.05)，较高于阳性药物组，差异不显著。两组牦牛贫血现象均有改善。说明百部与青蒿均有防治牦牛梨形虫病的效果，百部可作为高效防治牦牛梨形虫病的药物。

4 结论

本试验首次对道孚县牦牛梨形虫不同月份、年龄段及体重的感染情况进行调查，道孚县牦牛梨形虫感染率较高，不同月份、年龄段、体重间存在差异，优势虫种为中华泰勒虫，主要传播媒介为微小扇头蜱。中西药结合防治牦牛梨形虫病效果显著，百部与青蒿均有防治牦牛梨形虫病的效果。百部及青蒿防治梨形虫病，使用方便，农牧民自己即可操作，可减轻大群投药时的劳动强度，易推广。由于试验样本数太少，因此对于百部及青篙防治梨形虫病的有效成分及其药理作用机制尚待进一步深入研究。