羊肠毒血症的病原分离及PCR诊断

李生庆，张西云，李志宁，范玉霞，胡国元，黄 荣，王亭亭，李积良

（1.青海省畜牧兽医科学院，青海 西宁810016；2.青海省祁连县央隆乡兽医站，青海 祁连810400）

羊肠毒血症是由D型产气荚膜梭菌感染并在羊肠道中大量繁殖产生毒素所引起的一种急性毒血症。病羊死后肾组织易于软化，因此，该病又称“软肾病”。因该病发病急，死亡突然，且死亡率高，不易治疗，常常给养羊户带来较大的经济损失。

由于引起该病的病原菌为土壤常在菌，芽孢随饲料和饮水被羊食入，可长期存在于肠道中，当消化道机能受到损坏时，病原菌迅速繁殖并产生大量毒素，从而使羊发病死亡，因此，很难在胃肠道之外的其他脏器内分离到病原菌，这给该病的诊断工作增加了难度。鉴于此，根据D型产气荚膜梭菌所产的α、ε两种毒素设计具有特异性的扩增引物，进行PCR诊断可在很大程度上降低诊断的难度，并可节省时间，提高疫病诊断的精确性。

1 材料

1.1 病料来源 采集的病料为2009年9月青海省祁连县发生急性死亡的羊只脏器。

1.2 标准菌株 产气荚膜梭菌标准菌株C60－2，购自中国兽医药品监察所微生物室；腐败梭菌FB2010、乳酸大肠杆菌株（XR84）、金黄色葡萄球菌（JP86）为我室分离保存菌株。

1.3 培养基的制备 血液琼脂、厌气肝汤两种培养基均按常规制备，121℃灭菌40min，4℃保存备用。

1.4 试剂TaqDNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP（10mmol／L）、25mmol／L的 MgCl，均购自北京博迈德科技发展有限公司；琼脂糖为Biowest产品；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 试验动物 18～22g昆明系小鼠，购自青海省地方病研究所。

2 方法

2.1 病原分离 取病死羊肠道逐段抹片镜检，接种疑似菌密度较大肠段的内容物于加有新鲜生肝块的厌氧肉肝汤37℃培养24h，将该培养物接种于鲜血琼脂平板上，挑取疑似菌落，以得到疑似菌株的纯培养物；也可直接用肠内容物划线接种于鲜血琼脂平板，挑取疑似菌落。

2.2 动物试验

2.2.1 肠内容物毒素测定 将病死羊的回肠内容物1mL加入9mL生理盐水中，充分混匀后5 000 r／min离心30min，吸取上清液，用生理盐水作适当稀释后，在可能的毒力范围内静脉注射小鼠，每一滴度注射2只，0.2mL／只，观察记录小鼠发病、死亡情况，确定小鼠最小致死量。

2.2.2 分离菌株毒素测定 取该菌的纯培养物，5 000r／min离心30min，吸取上清1mL加含2.5 g／L胰酶的10g／L的碳酸钠溶液1mL，37℃活化30min后，用生理盐水倍比稀释，每一滴度静脉注射小鼠2只，0.2mL／只，观察记录小鼠发病、死亡情况，确定小鼠最小致死量。

2.3 D型产气荚膜梭菌的PCR检测

2.3.1 DNA模板的制备 将纯化的分离待检菌和标准阳性产气荚膜梭菌分别接入厌氧肉肝汤中，37℃培养24h，取1.5mL培养液于离心管中12 000r／min离心1min，弃去上清液，用1×PBS 200 μL悬浮菌体，13 000r／min离心1min，弃上清后加入200μL1×PBS重悬，混匀后加入蛋白酶K 20 μL，再加200μL CB结合液，混匀后，70℃水浴放置10min.取出冷却后加100μL异丙醇，混匀。利用北京博迈德生物科技发展有限公司研制的组织／细胞DNA提取试剂盒提取DNA.提取物于4℃冰箱保存备用。

2.3.2 引物设计 根据GenBank中报道的产气荚膜梭菌基因序列及相关的参考文献［1－4］，分别在α毒素和ε毒素的保守区域设计2对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下：

α毒素：上游引物：5′－CACGATGTATCAGAGGGTA－3；下游引物：5′－TAAGTGTCTTTGCTTCCAG－3′

预期扩增片段大小：202bp

ε毒素：上游引物：5′－GTATCTAATGAAATGTCCA－3′；下游引物：5′－CTTCCACTTACTTGTCCTAC－3′

预期扩增片段大小：585bp

2.3.3 PCR扩增反应体系 PCR反应总体系为25μL：10×Buffer缓冲液 2.5μL，10mmol／L dNTP 1.0μL，上下游引物各0.5μL，模板 DNA 5.0μL，TaqDNA 聚合酶0.5μL，灭菌双蒸水14 μL。

反应程序为：96℃预变性20min，然后94℃变性30s，51℃延伸40s，72℃复性1min，共循环30次，最后在72℃延伸10min。

2.3.4 PCR产物电泳 PCR反应结束后取5μL产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳60V，65min，紫外灯下观察并拍照，分析PCR扩增结果。

2.4.5 PCR检测的特异性试验 分别以乳酸大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐败梭菌等作阴性对照，检测PCR反应的特异性。

3 结果

3.1 分离菌的形态与培养特性 小肠内容物涂片、革兰染色镜检，可见大量革兰阳性两端钝圆大杆菌，单个散在或成对存在。在厌氧肉肝汤培养24h后涂片见到与小肠内容物涂片相同的细菌；在鲜血琼脂平板上厌氧培养，24h开始生长，48h可见圆形略隆起、灰白色半透明的菌落，菌落周围有溶血环，涂片镜检可见与肠内容物涂片相同的细菌。

3.2 动物试验结果 肠内容物离心上清注射小鼠后可见兴奋、转圈、翻滚等症状，分别于4～22min内死亡。测得其小鼠最小致死量为200～400 MLD／mL；分离菌培养物的最小致死量为200～1 600MLD／mL。

3.4 PCR扩增结果 利用合成的2种引物进行PCR扩增，标准菌株C 602和分离菌株都扩增出大小为202bp的α毒素及585bp的ε毒素的目的条带，结果如图1。

图1 产气荚膜梭菌分离株PCR扩增图

3.5 特异性试验 在相同条件下，只有标准菌株和两株分离菌扩增出大小202bp的α毒素及585bp的ε毒素相应条带，其他腐败梭菌、乳酸大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均未扩增出上述条带，表明试验结果具有好的特异性。结果如图2。

图2 特异性扩增结果

4 讨论

长期以来，主要采用动物毒素中和试验来鉴别产气荚膜梭菌的菌型，操作起来比较繁琐，而且有诸多不定的影响因素，容易造成误差。本试验采用的PCR方法则可直接检测毒素的基因，从而不依赖于该菌是否产生了肠毒素。结果表明，PCR诊断方法快速、准确，提高了检测的准确率和敏感性，加强了时效性，取得了良好的诊断效果。为疾病的快速诊断，流行病学调查提供了科学依据，为建立多重PCR诊断方法奠定了基础。

［1］龚玉梅，Pat Blackall，陈卓明，等.产气夹膜梭菌型特异性多重PCR 的研究［J］.中国兽药杂志，2004，38（2）：22－25.

［2］文其乙，刘秀梵.多重PCR方法快速检测粪样中产气夹膜梭菌［J］.中国预防兽医学报，2002，24（1）：48－51.

［3］Augustynowicz E，Gzyl A，Slusarczyk J.Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens with a duplex PCR［J］.Diagnostic Microbiology.2002：169－172.