SEA诱导人膀胱癌T24细胞周期进程及凋亡

孟勇男 孙立群 (白山市中心医院泌尿外科，吉林 白山 34300)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一〔1〕。由于膀胱癌具有异质性，其生物学行为复杂多变，因而影响膀胱癌的治疗和预后。本研究应用葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导人膀胱癌T24细胞，观察其生物学行为变化，旨在为人膀胱癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人膀胱癌T24细胞株，吉林省肿瘤研究所惠赠。SEA由军事医学科学院微生物流行病学研究所提供;噻唑蓝(MTT)试剂、RPMI 1640培养基购于美国Sigma公司，胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 取指数生长期的人膀胱癌T24细胞，调细胞数为2×105/ml;接种于96孔塑料培养板内100 μl/孔，当细胞生长达到80%汇合时，每孔内分别加入不同浓度的SEA溶液0、20、40、80 ng/ml，每个浓度10 复孔，静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后加入二甲基亚砜溶液150 μl/孔，振荡5 min，使MTT还原产物完全溶解，于酶标仪570 nm处测量各孔吸光度A值，按下列公式计算T24细胞的增殖抑制率。T24细胞抑制率=(1－加药孔细胞A值÷对照孔细胞值)×100%。

1.2.2 流式细胞术 细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔培养板改为25 ml培养瓶，培养结束后用0.25%胰蛋白酶消化。收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上机前过40目网，调细胞数为1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以Modiffi 2.0软件分析。

1.2.3 透射电镜观察 细胞培养及分组同1.2.2，收集不同浓度的SEA作用的T24细胞，移入锥形离心管内，离心弃上清，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅-铀双重染色，透射电镜观察并拍照。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件进行分析，数据资料以s表示，组间比较采用t检验，F检验。

2 结果

2.1 MTT结果 不同浓度的SEA对T24细胞的增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比差异显著(P＜0.01)。见表1。

2.2 流式细胞术结果 不同浓度的SEA对T24细胞增殖均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，组间比较差异显著。见表2。

2.3 透射电镜结果 见图1。20 ng/ml SEA组，T24细胞膜破裂，线粒体肿胀，有空泡形成;40 ng/ml SEA组，细胞核染色质趋边凝集，大量空泡形成;80 ng/ml SEA组，细胞核破裂，可见凋亡小体改变。

表1 不同浓度的SEA对T24细胞的增殖抑制率(s)

表1 不同浓度的SEA对T24细胞的增殖抑制率(s)

组别 A值 抑制率 P值

表2 不同浓度的SEA对T24细胞周期进程的影响( s ，%)

表2 不同浓度的SEA对T24细胞周期进程的影响( s ，%)

与0 mg/ml组比较：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

29.6±2.1 63.2±3.4 7.1±1.9 20 ng/ml组 42.6±3.81) 41.4±392) 15.9±2.62)40 ng/ml组 51.3±1.61) 29.6±3.32) 19.1±2.72)80 ng/ml组 59.3±0.212) 19.9±2.42) 21.2±3.12)/M 0 ng/ml组组 别 G0/G1 S G2

图1 各组细胞透射电镜下改变

3 讨论

SEA是一组对热稳定的可溶性蛋白质，能抵抗胃肠液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常见病因〔2〕。SEA杀伤肿瘤细胞有两种途径：(1)直接的细胞毒效应，(2)间接杀伤肿瘤细胞，不需加工直接与自身组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子结合形成配体，通过该配体抑制细胞增殖。王琳〔3，4〕等分别应用抗体耦联SEA和直接应用SEA对荷瘤小鼠的治疗获得较为满意的结果。

本研究MTT结果显示不同浓度的SEA对T24细胞增殖抑制率具有明显的剂量依赖性。流式细胞仪结果显示，不同浓度的SEA对T24细胞周期进程均有影响。G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反映〔5〕。G1期细胞又称细胞复制前期，G1期是制造和产生rRNA、mRNA和tRNA及核蛋白体的时期，也是多种化学药物作用的敏感点〔6〕。因此，抑制G1期细胞进程，从而使细胞增殖变缓，可达到抑制肿瘤增殖的目的〔7〕。

本研究证明SEA具有直接的细胞毒作用，可用于肿瘤的治疗。尤其是膀胱癌属于腔内浅表肿瘤，直接膀胱灌注即能杀伤肿瘤细胞，又便于直接排出体外，避免毒副作用的产生，因此，SEA用于膀胱癌的治疗有广阔的应用前景。

1 张 宇，倪泽称，胡岚亭，等.双色荧光原位杂交技术在膀胱尿路上皮肿瘤诊断中的应用价值〔J〕.国外医学肿瘤杂志，2012;39(3)：237-40.

2 Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al.Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins〔J〕.Chem Immunol Allergy，2007;93：24-41.

3 王 琳，舒晓钢.SEA-FAb'偶联蛋白对胃癌的抑制作用及其机制〔J〕.中华实验外科杂志，2003;20(5)：425-6.

4 张 云，孙嘉琳，王 雪，等.SEA体内杀伤S180肉瘤效果及其细胞因子测定〔J〕天津医药，2010;38(4)：313-5.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Celss，2000;5(6)：491-8.

6 Martin LG，Demers GW，Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papiloma Viras type/6 E7 expressing human cells in associated regulation of cyclin E〔J〕.J Virol，1998;72(2)：975-85.

7 Jie KG，Jiang H，Sun L，et al.The pilot study of anti-tumor effects versus immunosuppression of Staphylococcal Enterotoxin C〔J〕.Cancer Biol T-her，2007;6(10)：1584-91.