白介素-21对细胞毒T淋巴细胞杀伤非霍奇金淋巴瘤的影响

刘红艳 叶 松 冉昌丽 王海燕 郭静明

(宜昌市中心人民医院血液科 三峡大学第一临床医学院，湖北 宜昌 443003)

非霍奇金淋巴瘤(NHL)按目前常规的治疗方案(如CHOP方案)，约有30% ～40%的病例可长期缓解，但是仍有约60%～70%的患者常规治疗失败和复发，挽救性治疗的效果较差。因此迫切需要发现更有效的治疗手段和措施。白介素-21(IL-21)是一类新发现的细胞因子，与Th1密切相关，发挥防御肿瘤的作用〔1〕，与其他抗肿瘤制剂联用还可减少制剂用量，延长患者存活期〔2〕。IL-21还能通过提高细胞毒 T淋巴细胞(CTL)、T淋巴细胞及NK细胞的增殖，增强其杀伤肿瘤的细胞毒作用，同时促进干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α的分泌，增强杀伤细胞的敏感性，从而发挥其免疫增强的作用。本课题通过实验，说明IL-21能促进CTL增殖而杀伤NHL细胞的作用，为临床治疗提供潜在的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 人非霍奇金淋巴瘤细胞株(Raji)购自同济医学院附属协和医院血液病研究所，单个核细胞来自健康人外周血。

1.2 主要试剂 RPMI1640，IMDM，FBS购自 Gibco公司，Fi-coll购自武汉御和生物公司，抗CD2磁珠购自Miltenyi公司。TNF-α、IL-21购自Pepro Tech公司。ELISA试剂盒购自Bender公司。TRIZOL为Invitrogen公司产品，逆转录试剂盒、Taq DNA和dNTP为Fermentas公司产品，PCR引物由上海生物工程公司合成，DNA Marker购自深圳晶美公司，EDTA及EB为Sigma公司产品，琼脂糖购自Biowest公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养树突细胞(DCs)抽取健康人外周血10 ml，肝素抗凝(20 U肝素/1 ml全血)。将全血用RPMI-1640对倍稀释，充分混匀。向干净的离心管中加入0.077 g/ml Ficoll-Hypaque细胞分离液10 ml，离心15 min。用吸管取中间的淡黄色单个核细胞层。用Hank's液洗涤2次，弃上清液，用RPMI-1640洗涤1次，离心。调整细胞浓度为2×105/ml，加入磁珠标记的抗CD2单抗于10℃，将细胞混液加入到Mini MACS细胞分离柱中，以IMDM培养基，此即为CD2+的DC细胞。

1.3.2 诱导肿瘤特异性CTL 以含10%FBS、1% 抗生素、GM-CSF(1 000 U/ml)、IL-4(500 U/ml)、TNF-α(1 000 U/ml)的RPMI-1640悬浮细胞，同时加入淋巴瘤细胞冻融抗原50 μl，接种于60 cm2的培养皿中，37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3.3 实验分组 将此培养液分为对照组和实验组，实验组于第7天后加入100 ng/ml的IL-21。14 h后以ELISA法、RTPCR检测IFN-γ和TNF-α浓度，皆按照试剂盒说明进行。

1.4 统计学分析 数据采用SPSS11.0医用统计软件进行分析，计量资料用s表示，采用χ2检验进行检验分析。

2 结果

2.1 IL-21影响CTL上清中的细胞因子IFN-γ 和TNF-α 经IL-21(100 ng/ml)诱导，CTL细胞14 h上清中IFN-γ的含量为(469.32 ± 2.83)pg/ml，TNF-α 为(82.52 ± 4.72)pg/ml;对照组上清中IFN-γ 的含量为(27.63 ± 2.76)pg/ml，TNF-α 为(11.63±1.54)pg/ml，两组相比差异显著(P＜0.05)。

2.2 IL-21影响CTL中 IFN-γ 和 TNF-α 的 mRNA表达 CTL细胞经培养14 h后，分别提取有无IL-21诱导的各组mRNA，测定IFN-γ 和 TNF-α 的 mRNA 表达量(图 1)。IFN-γ 和 TNF-α的mRNA表达量，均随着培养的时间延长而减少，见表1。

图1 IL-21对CTL中IFN-γ和TNF-α mRNA表达的影响

表1 IL-12对CTL中IFN-γ mRNA表达的影响(s)

表1 IL-12对CTL中IFN-γ mRNA表达的影响(s)

与对照组比较：1)P＜0.05

组别 IFN-γ TNF-α对照组40 000±1 100 6 000±154实验组 4 800±2471) 213±1021)

3 讨论

机体的免疫系统能够识别和清除肿瘤细胞，因此利用自身T淋巴细胞和抗原提呈细胞杀伤肿瘤细胞的细胞免疫治疗已经得到广泛应用。DCs不仅可以有效摄取和提呈肿瘤抗原，而且通过提供活化T细胞所必需的共刺激信号，使T细胞被充分激活和有效增殖。因此，利用DCs提呈肿瘤抗原进而诱导特异性CTL是肿瘤免疫治疗的一个热点。

IL-21主要是由活化后的CD4+T细胞分泌。RT-PCR研究结果显示在机体正常情况下IL-21的表达量很少，但在模拟T细胞活化的条件下可诱导IL-21的高水平表达，IL-21主要起着广泛的免疫调节功能。众多的研究表明，IL-21可以增强肿瘤免疫治疗的效果。在用DCs细胞诱导产生的抗自体黑色素瘤CTL中，IL-21可以成10倍增加CTL的增殖及活性〔3〕。IL-21可提高CTL的增殖和增强其杀伤肿瘤的细胞毒作用〔4〕，并促其分泌IFN-γ，IFN-γ可上调肿瘤细胞表面MHC-I类分子的表达，增强对杀伤细胞的敏感性〔5，6〕。在本次研究中，有IL-21实验组，DC诱导的CTL产生IFN-γ和TNF-α明显增加，此两种细胞因子分泌的增加大大提高了CTL对Raji细胞的杀伤作用。证实IL-21促进CTL对Raji细胞杀伤可能部分是通过促使CTL高表达IFN-γ和TNF-α而实现。

1 姚金晶，陈宜涛.Th1/Th2平衡调节与疾病发生的研究进展〔J〕.现代生物医学进展，2009;9(13)：2597-600.

2 Skak K，Kragh M，Hausman D，et al.Interleukin 21：combination strategies for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2008;7(3)：231.

3 赵明峰.白细胞介素21——一种新的免疫系统调节因子〔J〕.国际免疫学杂志，2008;31(3)：360-4.

4 van derVliet HJ，Koon HB，Yue SC，et al.Effects of the administration of high-dose interleukin-2 on immunoregulatory cell subsets in patients with advanced melanoma and renal cell cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(1)：2101-8.

5 Skak K，Kragh M，Hausman D，et al.Interleukin 21：combination strategies for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2008;7(2)：231-40.

6 Sondergaard H，Frederiksen KS，Thygesen P，et al.Interleukin 21 therapy increases the density of tumor infiltrating CD8+T cells and inhibits the growth of syngeneic tumors〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2007;56(9)：1417-28.