乙酰半胱氨酸对脑死亡时肺组织形态和NF-κB表达的影响

苗丽君 高增艳 王 静 蒋军广 孙振涛 韩雪萍 张水军

(郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州450052)

脑死亡供体可有效缓解器官来源缺乏和提高移植效果， 但脑死亡后供体器官损伤可能会对移植后功能产生不良影响，如何进行脑死亡供体器官保护已成为研究的重点。核因子(NF)-κB调控着机体几乎所有炎症介质的转录，与肺损伤密切相关〔1〕。目前，有关脑死亡状态对肺组织NF-κB表达的影响尚不完全明确。本实验拟观察脑死亡状态对肺组织形态和肺组织NF-κB mRNA及其蛋白表达的影响，以及乙酰半胱氨酸 (NAC)干预处理对肺脏形态的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及处理 第三军医大学实验动物中心提供的健康巴马小型猪15只，6月龄，雌雄不限，体重(25±4)kg，术前12 h禁食，自由饮水。麻醉后行开颅术，颅内放置Foley气囊导管。随机分为对照组、脑死亡组与NAC组，每组5只。对照组持续麻醉维持24 h，不建立脑死亡模型;24 h后撤除麻醉，动物苏醒后处死。参照文献〔1〕建立脑死亡模型，通过呼吸、循环支持维持动物脑死亡状态24 h;24 h后撤除呼吸、循环支持，动物心肺死亡。NAC组于脑死亡模型建立成功后开始经静脉给予NAC 150 mg/kg混合在100 ml生理盐水中滴注1 h，随后150 mg/kg混合在250 ml生理盐水中滴注23 h。

1.2 标本采集及检测方法 脑死亡后24 h取出肺脏，切取右肺下叶组织块。(1)常规石蜡包埋，行苏木素-伊红(HE)染色观察肺脏组织变化。(2)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织NF-κB mRNA的表达：TRIzol法提取肺组织总RNA，逆转录后行PCR，NF-κB及内参照 β-actin引物根据 GenBank中相应基因序列设计，由大连宝生物工程公司合成。NF-κB引物序列：上游5'-CAT CTC CCT GGT CAC CAA GGA-3'，下游 5'-CGC ACA GCA TTC AGG TCG TAG-3'，片段长度约为254 bp;β-actin引物序列：上游 5'-CAT CCT GCG TCT GGA CCT-3'，下游5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3'，片段长度约480 bp。产物置于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，凝胶图像分析仪测目的基因及内参照吸光度值并摄像，以NF-κB/β-actin的吸光度比值代表NF-κB mRNA的相对表达水平。(3)S-P免疫组织化学染色法检测NF-κB蛋白表达，S-P免疫组化试剂盒、显色试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司，NF-κB试剂盒购自武汉博士德生物公司。免疫组化结果判定：细胞染色棕黄色者为阳性，着色定位于胞核和(或)胞质，每张切片随机选择5个高倍镜视野，记数阳性细胞，阳性率=阳性细胞数/总细胞数。

2 结果

2.1 肺脏组织形态学变化 光镜结果显示：对照组肺脏组织结构基本正常。脑死亡组存在肺间质弥漫性水肿，肺泡间隔增宽，肺泡腔有渗出液，局灶性肺不张，肺泡萎陷，肺毛细血管充血，肺微血管中有嗜中性粒细胞积聚附壁，肺组织中有淋巴细胞浸润。NAC组有轻微病理改变，肺泡腔纤维蛋白少许渗出，肺泡间隔轻度增宽，偶见管腔内上皮细胞脱落，罕见肺泡腔及间隔中性粒细胞渗出，淋巴细胞浸润较C组增多。见图1。

2.2 各组NF-κB mRNA及蛋白表达水平 脑死亡组、NAC组NF-κB mRNA及蛋白表达水平均较对照组升高(P＜0.05);但NAC组升高幅度较脑死亡组低(P＜0.05)。见图2，图3，表1。

图1 各组肺组织病理改变(HE染色×400)

图2 各组肺组织NF-κB表达(×400)

表1 各组NF-κB mRNA及蛋白的表达水平( s ，n=5)

表1 各组NF-κB mRNA及蛋白的表达水平( s ，n=5)

与对照组组间比较：1)P＜0.05;与脑死亡组比较：2)P＜0.05

组别 NF-κB mRNA(吸光度比值)NF-κB蛋白(阳性细胞率)0.648±0.171 0.091 0±0.021 3脑死亡组 2.036±0.1021) 0.718 9±0.061 61)NAC组 0.958±0.0891)2) 0.310 9±0.023 21)2)对照组

图3 NF-κB mRNA RT-PCR产物电泳图

3 讨论

目前对有关脑死亡后肺脏改变的机制所知较少且不统一，研究发现，脑外伤、脑出血、脑卒中等均可并发神经原性肺水肿、急性肺损伤等〔2，3〕。近年来，随着脑死亡的研究进展，炎症介质在外周器官损伤中的作用日益受到人们的重视〔4〕。本实验系列研究已经证实，脑死亡状态下巴马猪血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子表达水平增高，提示脑死亡与炎症介质关系密切〔5，6〕。

NF-κB是广泛存在于多数细胞中的一种基因转录因子，目前被认为是调控机体炎症反应的总源头，调控着机体几乎所有炎症介质的转录，与机体免疫应答、缺血再灌注损伤、凋亡、炎症等关系密切〔7〕。机体受到创伤、氧化、应激等刺激后可刺激靶细胞，使NF-κB的诱导激酶活化，激活IKK，I-κB快速磷酸化降解，从而使 NF-κB 活化，发生核移位〔8，9〕，与靶基因结合，调控细胞因子、黏附分子和炎症相关的酶及蛋白质的表达，上调多种炎症介质如：TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、氧自由基等，直接参与脏器的损伤。细胞因子与NF-κB以及细胞因子间复杂的相互作用，导致机体炎症反应失控引起肺损伤。在小鼠模型的研究已经证实NF-κB参与了许多肺部炎症性疾病，如急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征，并且认为“遏制”而不是“废除”NF-κB活化可能是一种安全有效的治疗策略〔10〕。本实验表明，脑死亡组肺组织NF-κB mRNA及其蛋白表达水平较对照组明显升高，肺组织较对照组有明显损伤性改变：肺间质弥漫性水肿、肺泡腔渗出、局限性肺不张、肺组织炎性细胞浸润，提示NF-κB可能参与了脑死亡状态下的肺损伤。

NAC是一种经典的化痰药物，近年来发现NAC还具有较强的抗氧化和促肺表面活性物质生成作用。NAC是体内游离巯基的重要组织成部分，也是谷胱甘肽(GSH)的前体物质，可促进GSH的合成，从而增加GSH氧化还原这一循环作用，增加自由基清除〔11〕。许多临床证据表明，NAC对多种呼吸道疾病如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、支气管哮喘、肺损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺间质纤维化、脏器缺血再灌注损伤等均具有很好的治疗和预防作用〔12～14〕。另外 NAC是 NF-κB的抑制剂，可有效抑制NF-κB的活化，调控细胞凋亡，相应地降低炎性细胞因子水平从而起到细胞保护作用。本实验表明，应用NAC后脑死亡状态下肺组织损伤明显减轻，NF-κB mRNA及其蛋白表达水平较B组也明显下降，提示NAC对NF-κB的表达具有抑制作用，对脑死亡肺损伤具有保护作用。

脑死亡后肺组织出现损伤性改变，肺组织NF-κB mRNA及其蛋白表达水平增高，提示NF-κB参与了脑死亡肺损伤的过程。当应用NAC后，肺组织NF-κB表达降低，肺脏损伤性改变减轻，提示NAC通过抑制NF-κB的表达对肺损伤具有保护作用。本实验有可能为临床器官移植肺保护提供指导意义。

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