牡荆子的化学成分与生物活性研究

李月婷等

[摘要] 研究牡荆Vitex negundo var. cannabifolia果实的化学成分及其生物活性。利用硅胶、Sephadex LH20柱色谱和半制备HPLC等色谱方法分离纯化，结合其理化性质和MS、NMR等波谱学数据鉴定化合物的结构。从牡荆子70%丙酮提取物的二氯甲烷萃取部位分离鉴定了19个化合物，包括13个木脂素和6个酚类化合物，分别鉴定为6羟基4（4羟基3甲氧基苯基）3羟甲基7甲氧基3，4二氢2萘醛（1），6羟基4（4羟基3甲氧基苯基）3羟甲基5甲氧基3，4二氢2萘醛（2），vitexdoin F（3），去四氢铁杉脂素（4），vitexdoin E（5），4氧代芝麻素（6），L芝麻素（7），（+）beechenol（8），ligballinol（9），2（4hydroxyphenyl）6（3methoxy4hydroxyphenyl）3，7dioxabicyclo[3.3.0]octane（10），松脂素（11），balanophonin（12），theroguaiacylglycerolβconiferyl aldehyde ether（13），对羟基肉桂醛（14），松柏醛（15），5，7二羟基色原酮（16），反3，5二甲氧基4羟基肉桂醛（17），覆盆子酮（18）和alternariol 4methyl ether（19）。化合物8～10，14，18，19为首次从马鞭草科植物中分离得到，化合物13为首次从牡荆属植物中分离得到，化合物6，7，12，15～17为首次从该植物中分离得到。对分离得到的化合物进行了体外抗炎和细胞毒活性评价，8个化合物（3，5，7，10，11，14，15，17）能够明显抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞释放一氧化氮（NO），其IC50在7.8～81.1 μmol·L-1；4个化合物（1～4）对HepG2细胞具有明显的细胞毒作用，IC50在5.2～24.2 μmol·L-1。

[关键词] 牡荆子； 木脂素； 酚类化合物； 抗炎； 细胞毒

Chemical constituents from the fruits of Vitex negundo var. cannabifolia and

their biological activities in vitro

LI Yueting1，2， PANG Daoran1，2， ZHU Zhixiang1， HUO Huixia1，2， REN Yi1，2，

PENG Zhitian1，2， ZHENG Jiao1， ZHAO Yunfang1*， TU Pengfei1， LI Jun1*

（1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Chemical constituents from the fruits of Vitex negundo var. cannabifolia and their nitric oxide （NO） inhibitory and cytotoxic activities were investigated. The compounds were isolated and purified by various column chromatography， and their structures were identified by physiochemical properties and spectroscopic data. Thirteen lignans and six phenolic compounds were isolated from the CH2Cl2 extract of the fruits of V. negundo var. cannabifolia， respectively. Their structures were elucidated as 6hydroxy4（4hydroxy3methoxyphenyl）3hydroxymethyl7methoxy3，4dihydro2naphthaldehyde （1）， vitedoin A （2）， vitexdoin F （3）， detetrahydroconidendrin （4）， vitexdoin E （5）， 4oxosesamin （6）， Lsesamin （7）， （+）beechenol （8）， ligballinol （9）， 2（4hydroxyphenyl）6（3methoxy4hydroxyphenyl）3，7dioxabicyclo[3.3.0]octane （10）， （–）pinoresinol （11）， balanophonin （12）， theroguaiacylglycerolβconiferyl aldehyde ether （13）， transpcoumaryl aldehyde （14）， coniferyl aldehyde （15）， 5，7dihydroxychromone （16）， trans3，5dimethoxy4hydroxycinnamic aldehyde （17）， frambinone （18）， and alternariol 4methyl ether （19）. Compounds 810，14，18，19 were firstly isolated from Verbenaceae family， compound 13 was obtained from Vitex species， and 6，7，12，1517 from V. negundo var. cannabifolia for the first time， respectively. The isolated compounds were evaluated for their antiinflammatory and cytotoxic effects in vitro. Eight compounds （3，5，7，10，11，14，15，17） showed inhibition against NO production in LPSstimulated RAW 267.4 cells （IC50 in the range of 7.881.1 μmol·L-1） and four compounds （14） showed cytotoxicity on HepG2 cells （IC50 in the range of 5.224.2 μmol·L-1）.

[Key words] Vitex negundo var. cannabifolia； lignan； phenolic constituent； antiinflammatory activity； cytotoxicity

doi：10.4268/cjcmm20162219

牡荆子为马鞭草科牡荆属植物牡荆Vitex negundo var. cannabifolia的干燥成熟果实，具有除湿祛痰，止咳平喘，理气止痛的功效，主要用于咳嗽气喘，胃痛，泄泻，痢疾，疝气痛，脚气肿胀，白带，白浊等[1]。化学研究表明牡荆子主要含黄酮[24]、木脂素[3，5]、三萜[4]、环烯醚萜[3]等化合物。现代药理研究表明其具有平喘[6]、镇痛[7]、抗菌[1]、抗炎[8]、抗氧化[5]和抗肿瘤[9]等作用。为进一步阐明牡荆子的有效成分，本课题组对牡荆子70%丙酮提取物的二氯甲烷萃取部位进行了系统的化学成分研究，共分离鉴定了19个化合物，包括13个木脂素（1～13）和6个酚类化合物（14～19）。其中化合物8～10，14，18，19为首次从马鞭草科植物中分离得到，化合物13为首次从牡荆属植物中分离得到，化合物6，7，12，15～17为首次从牡荆中分离得到。

1 材料

高效液相离子阱飞行时间质谱仪（日本岛津公司）；Varian 500 核磁共振仪（美国Varian公司）；半制备型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；半制备HPLC色谱柱（YMCPack ODSA， 10 mm×250 mm， 5 μm）。Sephadex LH20 填料（Amersham Biosciences，瑞典）；ODS（40～63 μm，德国Merck）；柱色谱用硅胶（200～300目）及薄层色谱用GF254硅胶预制板均为青岛海洋化工厂生产。丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等均为分析纯。

牡荆子于2012年9月采自河南省信阳市，由北京大学药学院天然药物学系屠鹏飞教授鉴定为V. negundo var. cannabifolia的干燥成熟果实。标本存放于北京中医药大学中药现代研究中心（JLIVNC201209）。

2 提取与分离

干燥并粉碎的牡荆子药材（6.5 kg）在室温下分别用70%丙酮浸泡提取3次（每次溶剂40 L，浸泡24 h），过滤，合并提取液，浓缩得浸膏（450 g）。取浸膏400 g，用90%甲醇溶解，依次用正己烷、二氯甲烷萃取，得到正己烷部位（180 g）、二氯甲烷部位（90 g）、水部位（110 g）3个萃取部位。

二氯甲烷萃取物（80 g）经硅胶（200～300目）柱色谱分离，正己烷乙酸乙酯（3∶1～0∶1）、二氯甲烷甲醇（25∶1～0∶1）梯度洗脱得到11个流分（Fr.1～11），Fr.11经重结晶，得到1（8.0 g），Fr.11的结晶母液经半制备液相色谱纯化得3（2.0 mg）。Fr.5经Sephadex LH20柱色谱，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脱得到7个流分（Fr.5a～5g）。Fr.5e，5f合并后经硅胶柱色谱和半制备液相色谱纯化得7（2.0 mg）。Fr.6经Sephadex LH20柱色谱，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脱得到4个流分（Fr.6a～6d）。Fr.6b经硅胶柱色谱和半制备液相色谱纯化得6（4.1 mg）和18（4.0 mg）。Fr.7经Sephadex LH20柱色谱，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脱得到8个流分（Fr.7a～7h）。Fr.7e经硅胶柱色谱和半制备液相色谱纯化得14（2.0 mg），15（2.5 mg）和19（2.3 mg）。Fr.8经Sephadex LH20柱色谱，二氯甲烷甲醇（1∶1）洗脱得到15个流分（Fr.8a～8o）。Fr.8i经硅胶柱色谱和半制备液相色谱纯化得5（4.5 mg）和8（3.6 mg）。Fr.8l经硅胶柱色谱和半制备液相色谱纯化得16（4.5 mg）。Fr.9经Sephadex LH20柱色谱，以甲醇洗脱得到8个流分（Fr.9a～9h）。Fr.9d经硅胶柱色谱和半制备液相色谱分离纯化得17（2.5 mg）。Fr.9e经硅胶柱色谱、ODS柱色谱和半制备液相色谱分离纯化得9（3.4 mg），10（2.1 mg）和11（2.4 mg）。Fr.10经硅胶柱色谱分离，正己烷乙酸乙酯（2∶1～0∶1）洗脱得到5个流分（Fr.10a～10e）。Fr.10c经Sephadex LH20柱色谱得4（10 mg）。Fr.10d经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH20柱色谱、ODS柱色谱和半制备液相色谱纯化得到2（5 g），12（2.3 mg）和13（2.6 mg）。

3 结构鉴定

4 药理活性筛选

4.1 体外抗炎活性测定[21] 取对数期生长的RAW 264.7细胞制备细胞数量为2×105个/mL细胞悬浮液，加入96孔板，每孔100 μL，于37 ℃在5% CO2的培养箱中培养24 h，将待测化合物用完全培养基稀释成不同浓度的工作液，每个浓度设置3个复孔。作用于RAW 264.7细胞1 h后，加入终浓度0.5 mg·L-1的LPS刺激RAW 264.7细胞，37 ℃孵育24 h后，利用Griess法测定细胞培养上清中NO浓度，利用MTT法测定96孔板中的细胞活力，并计算各浓度天然化合物对RAW 264.7细胞分泌NO的抑制率和对RAW 264.7细胞生长的抑制率。结果显示，化合物3，5，7，10，11，14，15，17能不同程度抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO，其IC50分别为（7.8±1.5），（51.0±2.2），（81.1±5.7），（27.9±17.5），（10.5±0.6），（9.4±0.2），（10.5±0.6），（21.4±1.0）μmol·L-1，阳性药吲哚美辛的IC50为（44.1±5.8）μmol·L-1；其他化合物在100 μmol·L-1（最高实验浓度）时的NO抑制率小于50%。所有化合物在100 μmol·L-1时对RAW 264.7细胞生长没有明显抑制作用。

4.2 MTT细胞增殖毒性测定 取对数期生长的HepG2人肝癌细胞制备细胞数量为3.5×104个/mL细胞悬浮液，加入96孔板，每孔100 μL，于37 ℃在5% CO2的培养箱中培养24 h使其完全贴壁，将待测化合物用完全培养基稀释成不同浓度的工作液，每个浓度设置5个复孔。于加药后48 h，每孔加入10 μL MTT试剂，在37 ℃作用2 h。用酶标仪测定在570 nm处的吸光度，计算细胞存活率。结果显示化合物1～4能不同程度抑制HepG2人肝癌细胞的生长，其IC50分别为（5.2±0.13），（19.7±1.44），（8.3±0.44）， （24.2±1.27） μmol·L-1。

5 讨论

本研究从牡荆子70%丙酮提取物的二氯甲烷萃取部位分离鉴定了19个化合物，主要以木脂素类化合物为主，其中13个化合物为首次从牡荆子中分离得到。同时，对分离得到的化合物进行了体外抗炎活性和细胞毒活性筛选。结果表明，8个化合物能够不同程度地抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO，具有一定的抗炎活性；4个化合物能显著抑制HepG2人肝癌细胞的增殖，具有较强的细胞毒活性，这些活性成分主要以木脂素类化合物为主。实验过程中发现，牡荆子中苯代萘型木脂素6羟基4（4羟基3甲氧基苯基）3羟甲基7甲氧基3，4二氢2萘醛（1）和6羟基4（4羟基3甲氧基苯基）3羟甲基5甲氧基3，4二氢2萘醛（2）含量很高，文献报道此类木脂素具有多种药理作用，如抗炎[8]、抗肿瘤[9]、神经保护[22]等，根据本研究结果并结合文献报道，推测牡荆子发挥药效的物质基础可能是其中含量较大的苯代萘型木脂素类成分，其作用机制仍需进一步探讨与研究。

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[责任编辑 丁广治]