O-去甲基文拉法辛对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19 活性的影响

刘明远 杨光远 杨 艳 孙严彤 赵锦程 朱秋双 张明远 白 雪 杨 玉 张 波

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

O-去甲基文拉法辛(ODV)，化学名称为1-〔2-(二甲基氨基)-1-(4-苯酚)乙基〕环己醇，是抗抑郁药文拉法辛的活性代谢物。与文拉法辛相同，ODV通过抑制5-羟色胺以及去甲肾上腺素的再摄取来治疗抑郁症、强迫症以及焦虑症，但副作用小，比其更安全〔1，2〕。药物对CYP450的影响是药物间相互作用的重要机制之一，而ODV对CYP450代谢酶活性的影响国内外文献鲜见报道。因此，明确ODV对CYP450酶各亚型的影响对了解其与临床其他药物的相互作用、指导临床合理用药具有重要的意义。本课题组前期实验结果表明，ODV对大鼠CYP450含量和CYP3A4活性无影响，对CYP2D6活性有抑制作用〔3〕，但未对肝微粒体亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19等酶活性进行评价，可能还存在诱导或抑制作用，尚需进一步研究。本研究进一步观察ODV对大鼠肝微粒体亚型CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性的诱导和(或)抑制作用，旨在为临床安全联合用药及相关实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物 健康Wistar大鼠〔购自长春高新医学动物实验研究中心，合格证号：SCXK-(吉)2003-0004)〕，体重200 ～250 g。

1.2 主要试剂与仪器 O-去甲基文拉法辛琥珀酸盐水合物原料药(含量＞98%，吉林省药物研究所);非那西丁、对乙酰氨基酚、甲苯磺丁脲、4'-羟基甲苯磺丁脲、美芬妥英、4'-羟基美芬妥英(Sigma公司);Unico uv-2100紫外分光光度计〔尤尼柯(上海)仪器有限公司〕;Agilent 1100高效液相色谱系统(美国Agilent公司);QTRAP型三重四极杆串联质谱仪(美国Applied Biosystem公司)。

1.3 方法

1.3.1 给药方案 健康Wistar大鼠18只，随机分成3组，每组6只，雌雄各半。动物经禁食过夜，对照组灌胃给予生理盐水，连续给药7 d;ODV给药组，灌胃给予ODV(22.90 mg/kg)，连续给药7 d;苯巴比妥诱导组，自ODV给药组给药至第5天开始腹腔注射苯巴比妥钠75 mg/kg，连续给药3 d。

1.3.2 肝微粒体的制备 在末次给药24 h后，拉颈椎处死动物，取出肝脏，立即置于冰冷的蔗糖溶液(0.25 mol/L，pH7.4)中清洗，剪碎，清洗至无血色;取肝重2 g，加1 ml蔗糖溶液，用组织匀浆机在冰浴中制成匀浆;4℃下离心20 min，再取上清液离心 60 min，沉淀用 Tris-HCl缓冲液(0.1 mmol/L，pH7.4)悬浮均匀，－80℃保存。

1.3.3 Lowry法检测蛋白浓度 依据Lowry等〔4〕方法，取牛血清白蛋白配制标准溶液，测定750 nm吸收度，以蛋白浓度C对吸收度A进行线性回归得标准曲线。用0.5 mol/L NaOH将肝微粒体样品稀释适当倍数后同法操作，依据标准曲线计算蛋白浓度。

1.3.4 CYP1A2活性测定 选择非那西丁作为CYP1A2的特异性底物〔5〕，建立定量测定非那西丁代谢物对乙酰氨基酚的HPLC-MS/MS分析方法。参照文献方法〔6〕，建立孵育体系，孵化10 min，取样100 μl，加入到200 μl冰冷的甲醇中终止反应。500 μl的 Tris-HCl缓冲液(pH7.4)孵育体系中含 NADPH 1.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L、MgCl2 10.0 mmol/L、大鼠肝微粒体蛋白1.0 mg/ml、非那西丁10.0 μmol/L，孵育体系中有机溶剂的终浓度约为0.01%。样品经处理后，高效液相色谱串联质谱法(样品处理过程及色谱、质谱条件略)测定样品中对乙酰氨基酚的含量。

1.3.5 CYP2C9活性测定 选择甲苯磺丁脲作为CYP2C9的特异性底物〔7〕，建立定量测定甲苯磺丁脲代谢物4'-羟基甲苯磺丁脲的HPLC-MS/MS分析方法。孵化体系、反应时间及反应终止同1.3.4，甲苯磺丁脲浓度为30.0 μmol/L，孵化体系中有机溶剂的终浓度约为0.06%。样品经处理后，高效液相色谱串联质谱法(样品处理过程及色谱、质谱条件略)测定样品中4'-羟基甲苯磺丁脲的含量。

1.3.6 CYP2C19活性测定 选择美芬妥英作为CYP2C19的特异性底物〔8〕，建立定量测定美芬妥英代谢物4'-羟基美芬妥英的HPLC-MS/MS分析方法。孵化体系、反应时间及反应终止同1.3.4，美芬妥英浓度为30.0 μmol/L，孵化体系中有机溶剂的终浓度约为0.3%。样品经处理后，高效液相色谱串联质谱法(样品处理过程及色谱、质谱条件略)测定样品中4'-羟基美芬妥英的含量。

1.4 统计学方法 使用SPSS17.0进行统计分析，计量资料采用s表示，组间比较用t检验。

2 结果

分别以各探针药物的代谢产物对乙酰氨基酚、4'-羟基甲苯磺丁脲及 4'-羟基美芬妥英 的 产率 (单位：nmol·mg protein－1·min－1)作为 CYP1A2、CYP2C9 及 CYP2C19 酶活性指标。ODV给药组与对照组大鼠肝微粒体 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19活性差异均无统计学差异(P＞0.05)，见表1。说明ODV对CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19亚型活性没有抑制或诱导作用。

表1 对照组、ODV组CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性(nmol·mg protein －1·min－1，s)

表1 对照组、ODV组CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性(nmol·mg protein －1·min－1，s)

6 0.106±0.05 0.118±0.05 0.025±0.01 ODV给药组CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19对照组组别 n 6 0.124±0.05 0.100±0.05 0.021±0.01

3 讨论

多种药物合用时，在药物的吸收、分布、代谢、排泄四个阶段均可能发生药物间相互作用，两种药物同时使用的潜在药物相互作用发生率为6%，五种药物为50%，八种药物增至100%，其中代谢性相互作用发生率最高，具有非常重要的临床意义。CYP450酶系是重要的药物代谢酶，在外源性化合物(包括药物和毒物)的生物转化中起着十分重要的作用，其活性决定药物的代谢速率，与药物的清除率有着直接关系，是造成代谢性药物相互作用的主要原因。老年人常多病共存，多药共服，更容易发生药物间相互作用。由于老年人抑郁症高发，抗抑郁药与其他药物合用在老年人中较为常见。而ODV具有极高的抗抑郁活性和耐受性，临床常用于抑郁症的治疗，因此，研究ODV对CYP450活性的影响也显得非常重要。

CYP450酶根据其氨基酸序列不同分为不同亚型，人体主要有五种 CYP450 酶，即 CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19。这五种细胞色素P450酶可以代谢约99%的通过细胞色素P450酶代谢的药物〔9〕。本课题组前期试验结果表明，ODV对大鼠 CYP450含量和 CYP3A4活性无影响，对CYP2D6活性有抑制作用。为了更全面掌握ODV对肝细胞色素P450酶的作用，本试验进一步探讨了ODV对肝微粒体CYP450酶CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性的影响。

本试验以22.90 mg/kg体重(相当于人体推荐用量)的剂量给予大鼠ODV原料药，连续给药7 d，测定了ODV直接给药对大鼠CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性的影响。结果显示，Wistar大鼠经过ODV处理后，与对照组比较，CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19活性均没有变化，说明 ODV对大鼠 CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19没有抑制或诱导作用，提示当ODV与某些主要经CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19代谢的药物合用时，发生代谢性药物相互作用的可能性较小。

ODV口服给药后对 CYP450酶 CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19的影响目前尚未见文献报道，本实验采用大鼠口服给药后肝微粒体体外孵育法，分别以非那西丁、甲苯磺丁脲及美芬妥英为CYP1A2、CYP2C9及CYP2C19的特异性底物，通过代谢产物的生成速度来评价酶的活性。这种方法的优点是重现性好，肝微粒体制备容易，匀浆易保存，孵育条件易优化。但药物对CYP450酶的抑制或诱导作用存在一定的种属差异〔10〕。ODV对人肝微粒体CYP450酶各亚型的作用，还有待进一步研究证实。

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3 刘明远，杨 艳，高 瞰，等.O-去甲基文拉法辛对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶含量及CYP2D6、CYP3A4活性的影响〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(7)：632-3.

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