丝胶对2型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡的保护作用

刘晓燕 付秀美 高 宇 陈志宏 (承德医学院附属医院内分泌科，河北 承德 067000)

丝胶对2型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡的保护作用

刘晓燕 付秀美1高 宇 陈志宏1(承德医学院附属医院内分泌科，河北 承德 067000)

目的观察丝胶对2型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡的保护作用。方法雄性SD大鼠36随机分为3组:正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组。链脲佐菌素(STZ，25 mg/kg，连续3 d)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型;待模型成功建立后，丝胶治疗组大鼠给予丝胶灌胃(2.4 g·kg－1·d－1)35 d。免疫组织化学染色观察胰岛β细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠胰岛β细胞Bax蛋白的表达明显升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白的表达明显降低(P＜0.01);与模型大鼠相比，丝胶治疗组大鼠胰岛β细胞Bax蛋白的表达明显降低(P＜0.01)，Bcl-2蛋白的表达明显升高(P＜0.01)。结论丝胶可通过上调胰岛β细胞Bcl-2蛋白的表达、下调胰岛β细胞Bax蛋白的表达，抑制2型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡，对糖尿病时胰岛细胞损伤具有一定的保护作用。

丝胶;2型糖尿病;胰岛β细胞;Bcl-2;Bax

针对糖尿病复杂的发病机制，有学者提出胰岛β细胞增殖、凋亡失衡在糖尿病发生发展的过程中具有重要作用〔1，2〕。有研究发现〔3，4〕，体内某些抗凋亡基因表达增强，可促进胰岛β细胞增殖、抑制其凋亡，进而对抗血糖的升高。本研究以链脲佐菌素(STZ)致2型糖尿病大鼠模型为研究对象，探讨了蚕茧提取物——丝胶对胰岛β细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的变化，以期为临床治疗糖尿病及其并发症提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 STZ购于美国Sigma公司，临用时用pH4.4的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液配成2%溶液。丝胶为彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成。血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司，批号:20071030。兔抗Bax及Bcl-2多克隆抗体，美国Santa Cruz公司，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验动物的选择及分组 清洁级雄性SD大鼠36只，分为正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组(n=12)。随机选取其中的12只作为正常对照组，不做任何处理。其余24只大鼠采用小剂量STZ连续(25 mg/kg，3 d)腹腔注射的方法建立2型糖尿病模型，以血糖≥16.7 mmol/L作为成模标准;待模型成功建立后，随机分为模型组和丝胶治疗组(n=12)，模型组大鼠不再做任何处理，丝胶治疗组大鼠给予丝胶(2.4 g·kg－1·d－1)灌胃 35 d。

1.3 检测血糖 各组大鼠用药结束后禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，离心后收集血清，采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。

1.4 胰岛β细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的检测 大鼠取血后断头处死，取胰腺入Bouins液固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。采用SP免疫组织化学染色观察胰岛β细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达。一抗均为兔抗，稀释浓度Bcl-2为1∶50、Bax为1∶100，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作为阴性对照，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性反应。定量分析:采用MiVnt图像分析系统在10×40倍显微镜下对免疫组化阳性结果进行定量分析，每张切片随机选取胰岛作为观察视野，计算阳性产物面积占胰岛面积的比值。每组随机选取5只大鼠，每只大鼠任选5张切片，每张切片选取3个胰岛，取平均值。

2 结果

2.1 各组大鼠的血糖 糖尿病模型大鼠的血糖明显高于正常大鼠(P＜0.01)，丝胶治疗组大鼠的血糖明显低于模型大鼠(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血糖及胰岛β细胞Bcl-2 Bax蛋白表达的比较(±s，n=12)

表1 各组大鼠血糖及胰岛β细胞Bcl-2 Bax蛋白表达的比较(±s，n=12)

与模型组比较:1)P＜0.01

组别 血糖(mmol/L)Bcl-2 Bax正常对照组 10.83±2.031) 0.017 4±0.000 81)0.301 5±0.017 41)模型组 29.45±4.82 0.007 6±0.000 6 0.539 8±0.041 1丝胶治疗组 13.20±4.091) 0.017 1±0.000 21)0.308 0±0.013 41)

2.2 各组大鼠胰岛β细胞Bcl-2蛋白的表达 Bcl-2蛋白免疫阳性产物为棕黄色颗粒状，位于细胞质，免疫阳性细胞主要为胰岛β细胞(图1)。Bcl-2蛋白定量分析结果见表1，糖尿病模型大鼠胰岛β细胞Bcl-2蛋白的表达明显低于正常大鼠(P＜0.01);丝胶可明显提高糖尿病模型大鼠胰岛β细胞Bcl-2蛋白的表达，丝胶治疗组大鼠胰岛β细胞Bcl-2蛋白的表达明显高于糖尿病模型大鼠(P＜0.01)。

2.3 各组大鼠胰岛β细胞Bax蛋白的表达 Bax蛋白免疫阳性产物为棕黄色颗粒状，位于细胞质，免疫阳性细胞主要为胰岛β细胞(图2)。Bax蛋白定量分析结果见表1，糖尿病模型大鼠胰岛β细胞Bax蛋白的表达明显高于正常大鼠(P＜0.01);丝胶可明显降低糖尿病模型大鼠胰岛β细胞Bax蛋白的表达，丝胶治疗组大鼠胰岛β细胞Bax蛋白的表达明显低于糖尿病模型大鼠(P＜0.01)。

图1 各组大鼠胰岛β细胞Bcl-2蛋白的表达(×400)

图2 各组大鼠胰岛β细胞Bax蛋白的表达(×400)

3 讨论

Bcl-2是目前公认的抗凋亡基因，可通过多种途径抑制细胞凋亡〔5，6〕;Bax是Bcl-2家族成员之一，可互相结合形成同源二聚体，诱导和促进细胞凋亡〔7，8〕。Bcl-2蛋白可以与Bax蛋白竞争结合，形成比Bax-Bax同源二聚体更稳定的Bcl-2-Bax异源二聚体，从而使Bax-Bax同源二聚体分开，减弱Bax蛋白的诱导凋亡作用。因此，细胞凋亡抑制因子Bcl-2和细胞凋亡促进因子Bax比率不同将决定细胞受到凋亡刺激信号后是生存还是凋亡，Bcl-2占优势则细胞存活，Bax占优势则细胞凋亡〔9〕。目前认为，在糖尿病的发生发展过程中，Bcl-2表达降低和(或)Bax表达升高是促使胰岛β细胞凋亡的重要原因之一。Federici等〔10〕的研究表明，高糖可导致Bax过度表达，使胰岛β细胞凋亡增加，提示高糖可通过改变Bcl-2家族之间的平衡影响β细胞的凋亡。

糖尿病属中国传统医学“消渴症”范畴，治疗原则为生精清热、润燥养阴等。蚕茧，蚕蛾科昆虫家蚕蛾的茧壳，性甘、温，无毒，具有滋阴润燥、生精止渴作用，主治多饮、不生肌肉、肾消白浊和上中二消〔11，12〕。丝胶为天然高分子水溶性蛋白，约占茧丝的30%，在缫丝和精练时极大部分作为废料遭到遗弃，学者们一直在探讨对丝胶的有效利用。本研究发现，丝胶可明显上调糖尿病模型大鼠胰岛β细胞Bcl-2蛋白的表达、下调胰岛β细胞Bax蛋白的表达。一方面，增多的Bcl-2蛋白可通过阻断凋亡信号传递和凋亡基因产物的表达、提高抗氧化能力抑制胰岛β细胞的凋亡;另一方面，增多的Bcl-2蛋白可与Bax蛋白竞争结合形成Bcl-2-Bax异源二聚体，减弱Bax蛋白诱导β细胞凋亡的作用。因此，本研究表明丝胶可明显抑制糖尿病时胰岛β细胞的凋亡，可保护糖尿病时胰岛β细胞损伤，对糖尿病及其并发症具有一定的治疗作用。

1 Kolaczynski JW，Caro JF.Insulin-like growth factor-1 therapy in diabetes:physiologic basis，clinical benefits，and risks〔J〕.Ann Intern Med，1994;120(1):47-55.

2 刘道平，汪寅章，黄兆坚.2型糖尿病患者血清GH、IGF-1浓度改变及相关因素的研究〔J〕.中国糖尿病杂志，2000;8(2):81-4.

3 Hanke J.Apoptosis in cultured rat islets of langerhans and occurrence of Bcl-2，Bak，Bax，Fas and Fas ligand〔J〕.Cells Tissues Organs，2001;169(2):113-24.

4 Laybutt DR，Kaneto H，Hasenkamp W，et al.Increased expression of antioxidant and antiapoptotic genes in islets thatmay contribute to beta-cell survival during chronic hyperglycemia〔J〕.Diabetes，2002;51(2):413-23.

5 张淑玲，董艳臣，常全忠，等.缺氧缺血性脑病大鼠脑多巴胺含量的动态变化及病理观察〔J〕.实用儿科临床杂志，2002;17(2):110-1.

6 金琳芳，陈同钰.Bcl-2基因蛋白家族与细胞凋亡〔J〕.医学综述，2005;11(5):446-7.

7 Madesh M，Hajnoczky G.VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrialmembrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release〔J〕.Cell Biol，2001;155(6):1003-15.

8 Theodorakis P，Lomonosova E，Chinnadurai G.Critical requirement of BAX formanifestation of apoptosis induced bymultiple stimuli in human epithelial cancer cells〔J〕.Cancer Res，2002;62(12):3373-6.

9 Del Principe MI，Del Poeta G，Venditti A，et al.Apoptosis and immaturity in acutemyeloid leukemia〔J〕.Hematology，2005;10(1):25-34.

10 FedericiM，Hribal M，Perego L，et al.High glucose causes apoptosis in cultured human pancreatic islets of Langerhans:a potential role for regulation of specific Bcl family genes toward an apoptotic cell death program〔J〕.Diabetes，2001;50(6):1290-301.

11 李时珍.本草纲目〔M〕.北京:人民卫生出版社，1985:1045-52.

12 鲍相敖.验方新编〔M〕.天津:天津科技出版社，1993:736-40.

Protective effects of sericin on islet cells apoptosis of type 2 diabetes rats

LIU Xiao-Yan，FU Xiu-M ei，GAO Yu，et al.
Department of Endocrinology，the A ffiliated Hospital of Chengde M edical College，Chengde 067000，Hebei，China

ObjectiveTo observe the protective effects of sericin on islet cells apoptosis of type2 diabetes rats.Methods36male SD rats were random ly divided into 3 groups and each group had 12 rats:normal control，diabetesmodel and sericin treatment groups.Diabetesmodel weremade by injecting 2%STZ(25mg/kg，3 d)into the abdominal cavity continuously.After the diabetesmodelwas successfully established，the rats in model group had no more treatment;the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin(2.4 g·kg－1·d－1)for 35 days.SP immunohistochemical staining was used to observe the expression of Bcl-2 and Bax protein in β cells of islet.ResultsCompared with normal control rats，the Bcl-2 expression inβ cells of islet of rats inmodel group was decreased obviously，Bax expression increased obviously(P＜0.01).Compared with model rats，the Bcl-2 expression inβcells of islet of rats in sericin treatmentwas increased obviously，Bax expression decreased obviously(P＜0.01).ConclusionsSericin can inhibitβ cell apoptosis by up-regulating Bcl-2 expression and downregulating Bax expression and have protective effects onβcells injury during diabetes.

Sericin;Type 2 diabetes;βcell of islet;Bcl-2;Bax

R587

A

1005-9202(2012)12-2525-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.039

河北省科技厅项目(No.08276101D-19);河北省教育厅项目(No.2006301)

1 承德医学院人体解剖学教研室

陈志宏(1971-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事神经解剖学研究。

刘晓燕(1965-)，女，硕士，副主任医师，副教授，主要从事糖尿病神经病变临床研究。

〔2011-09-16收稿 2011-12-20修回〕

(编辑 曹梦园)