前列腺癌组织miR-221和miR-222的表达及临床意义

张 进 (山东省医学科学院基础医学研究所，山东 济南 250062)

前列腺癌组织miR-221和miR-222的表达及临床意义

张 进 (山东省医学科学院基础医学研究所，山东 济南 250062)

目的探讨前列腺癌(PCa)组织中miR-221和miR-222的表达及其临床意义。方法采用茎环RT-PCR的方法检测8例正常前列腺组织、74例PCa组织及其对应的癌旁组织中miR-221和miR-222的表达情况，并结合临床病理资料进行统计学分析。结果miR-221和miR-222在PCa组织中的表达显著高于其对应癌旁组织(P＜0.05)及正常前列腺组织(P＜0.05)，其中miR-221的水平还与癌组织分化程度(P＜0.05)以及远端转移情况(P＜0.05)相关。结论miR-221和miR-222在PCa组织中表达量升高，其中miR-221的水平还与癌组织分化程度与转移相关，可能作为PCa诊断和预后的指标。

前列腺癌;miR-221;miR-222

前列腺癌(PCa)是男性泌尿生殖系统一种常见的恶性肿瘤，具有潜伏期长、发病率高的特点，且发现时常常已经是晚期〔1〕，目前尚无有效的早期检测手段〔2〕。真核生物中 miRNA广泛参与神经系统的发育〔3〕、胰岛素分泌和脂肪细胞调控〔4〕、造血和红系分化〔5〕、细胞凋亡和肿瘤形成〔6〕等生物学过程，也有研究提出将miRNA作为肿瘤分子标记物辅助癌症的诊断和预后〔7〕。miR-221与miR-222是两种与肿瘤发生关系非常密切的miRNA，研究发现miR-221和miR-222表达失调与许多肿瘤相关〔8～10〕。本研究旨在通过茎环 RT-PCR的方法检测PCa样本中miR-221和miR-222的表达情况，并分析两者与病人临床资料的相关性，探讨这两种小分子RNA在PCa发生发展中的作用及临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 对象 收集某医院2005年2月至2011年4月经直肠的前列腺穿刺活检和手术切除后液氮保存标本，均经病理组织学确诊为PCa的组织及其癌旁组织，各74例(其中有远端转移的24例)，另有8例正常前列腺组织作对照。组织保存方式为液氮冻存30 min后放入－80℃保存。

1.1.2 试剂与仪器 Trizol(Invitrogen)，鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTPs、SYBR Mastermix(Toyobo)、ABI7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)，分光光度仪(EPPENDORF)。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 取－80℃保存的组织标本在液氮中碾碎至粉状，加氯仿0.2 ml，剧烈震荡后室温静置 3 min，4℃12 000 r/min离心15min，取上清液约300～500μl移至新的EP管中;加500μl异丙醇，混匀后在碎冰中放置20 min;－20℃12 000 r/min离心120 min，去上清取沉淀，加1 m l 75%乙醇漂洗，4℃ 7 500 r/min离心5 min;吸去乙醇，空甩离心后再次吸尽乙醇，开盖室温晾干约5 min;加入焦碳酸乙二酯(DEPC)处理过的水20μl溶解，震荡混匀。采用德国Eppendorf公司分光光度仪(Biophotometer)检测 RNA溶液 OD260/OD280吸光值，计算RNA浓度和纯度，OD260/OD280＞1.8为合格，可用于后续实验;取2～5μg总RNA加入6 ×RNA loading buffer，1%琼脂糖电泳分析，其28 S与18 S条带亮度约为2∶1。

1.2.2 miRNA表达分析 以U6作为内参，分析miR-221及miR-222表达。RT-PCR所用引物由上海生工合成，具体序列见表1。取1μg总RNA以miR-221和miR-222茎环RT引物进行逆转录;逆转录的反应条件为16℃ 30 min，42℃ 30 min，75℃15 min，反应结束后－20℃保存。以15μl的反应体系进行实时定量PCR miRNA，反应体系包括 1μl RT产物，1× SYBR GreenⅠ Mastermix，0.5 μmol/L miRNA 特 异 前向引物，0.5μmol/L通用的反向引物;实时定量PCR反应条件为95℃10 min，40 个循环(95℃ 15 s，60℃ 1 min)，每个样品做 3 个复孔，ABI7500荧光定量PCR仪记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数，即Ct值，以U6为内参，以N=2－△Ct表示目的 miRNA的相对表达量。见表1。

表1 RT及PCR引物序列

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，配对比较使用非参数Wilcoxon符号秩检验，PCa组间比较使用Mann Whitney U检验;PCa组织中miR-221和miR-222与各临床病理参数之间的关系采用χ2检验或Fisher精确概率法进行统计学检验。

2 结果

2.1 miR-221和miR-222在PCa组织中的表达 miR-221和miR-222在PCa中的相对表达量中位数分别为501.5和570.1，均高于对应癌旁组织，采用配对样本的Wilcoxon符号秩检验其差异有显著性(P＜0.05)，即在PCa组织中miR-221和miR-222的表达量均显著高于癌旁组织及正常前列腺组织。见图1。

2.2 miR-221与miR-222表达与临床病理特征的关系 如表2所示，miR-221与miR-222在PCa组织中表达量一般高于其对应的癌旁组织，取癌组织对应癌旁组织中miR-221表达量上调倍数2倍以上的病例记为阳性(39例)，其余病例记为阴性(35例);同样的处理方式得到miR-221阳性病例37例，阴性病例37例。比较miR-221的表达与各临床病理参数之间的关系，发现miR-221的表达和肿瘤的分化程度以及有无转移相关。在分化程度低的癌组织中miR-221的表达量常高于其对应癌旁组织，而癌组织分化程度越高，其miR-221的表达水平与其对应癌旁组织的差别就越小。另外，在有远端转移的PCa病例中miR-221的阳性率显著高于没有远端转移的病例。

3 讨论

miRNA在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，在近年来PCa 的研究中，关于 miRNA 的内容也越来越多〔11，12〕。miR-221与 miR-222 是两种非常重要的 miRNA，在乳腺癌〔13，14〕、胶质母细胞瘤〔15〕、慢性淋巴细胞性白血病〔16〕、甲状腺癌〔10〕中均起着重要的作用，其中对于miR-221与miR-222在PCa中的研究近几年也渐渐展开，但是关于miR-221与miR-222在PCa中具体的临床应用研究尚无报道。本研究发现miR-221和miR-222在PCa组织中的表达显著高于其对应癌旁组织及正常前列腺组织，提示miR-221和miR-222可能作为PCa的一个诊断指标;而miR-221的水平与癌组织分化程度以及远端转移情况相关，说明miR-221可能在PCa的恶化进展过程中扮演重要角色。结合 miR-221 下游靶基因，如 p27〔8，10，16〕、p57〔8〕以及 Bmf〔9〕等基因的抑癌作用，本文结果推测miR-221随着PCa恶化进展而表达升高可能导致其下游一系列抑癌基因的沉默，从而对癌症的进一步恶化起了重要作用，而这种作用在多种癌症的发生发展过程中都可能普遍存在，正如前期在乳腺癌〔13，14〕、胶质母细胞瘤〔15〕、慢性淋巴细胞性白血病〔16〕、甲状腺癌〔10〕相关临床资料和细胞学实验报道中的那样。但是由于miR-221下游靶基因非常多，上游也有核转录因子-KB(NF-KB)、c-Jun等调控因子控制调节〔17〕，这些基因间直接或间接的相互作用非常可能形成一个复杂的交互调控网络，影响了在有限实验数据下对miR-221在PCa发生发展中具体作用机制的解释。总之，本研究揭示出miR-221和miR-222在PCa组织中表达量升高，以及miR-221的水平与癌组织分化程度、转移情况的相关性，可能为其作为PCa诊断和预后指标提供依据。

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R737

A

1005-9202(2012)12-2472-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.011

张 进(1982-)，女，讲师，主要从事免疫学研究。

〔2011-09-25收稿 2011-12-16修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)