白花蛇舌草悬浮细胞分批培养规律的研究

于瑞莲，许金国，顾晓娟

(南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210029)

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Wild.)是一年生披散草本，属茜草科(Rubiaceae)耳草植物的全草，广泛分布于亚热带地区，在我国主要分布于长江流域以南的广东、广西、福建等地。主要用于清热解毒、利尿消肿、止痛抗菌、活血止痛。民间常用此药内服，治疗小儿疳疾、毒蛇咬伤、癌肿及肠道疾病。外用治各种疮疡及跌打刀伤等症;为治疗肠痈、肝炎、泌尿系统感染等病的有效中药。

白花蛇舌草化学成分研究发现了多糖［1］、黄酮甙车叶草甙和3个环烯萜类化合物、熊果酸、齐墩果酸等多种化合物［2］。药理研究表明其具有增强动物免疫功能，保肝利胆，抗菌消炎等作用。近年来通过大量临床实践，发现本品有很好的抗肿瘤作用，临床广泛用于治疗多种恶性肿瘤［3-4］。

本实验利用从白花蛇舌草种子培育的试管苗的茎尖，建立了愈伤组织及悬浮细胞系，系统研究了其悬浮细胞系的建立与生长规律，从而为大规模培养提供了大量的理论与实验基础。

1 材料和方法

1.1 植物材料

白花蛇舌草种子由本校药用植物教研室提供;白花蛇舌草愈伤组织由本实验室诱导选育。

1.2 细胞悬浮系的建立

愈伤组织的诱导与继代培养［5］:取白花蛇舌草试管苗的茎尖接种于MS+2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)4.0mg/L+Kt(激动素)0.5mg/L［5］+3% 蔗糖的培养基，将茎尖的愈伤组织转接，进行继代培养2～3次，每20 d继代1次，采用100mL锥形瓶，装液量50mL，0.8% 琼脂粉固化，光照强度2 000 lx，光照时间12 h/d，温度保持(26±1)℃。

悬浮细胞系的建立与培养［6］:将继代培养15～20 d的生长均匀、质地松散、淡黄色半透明状愈伤组织2 g，置于含1mg/L NAA(α-萘乙酸)和3%蔗糖的液体培养基50mL中进行首次悬浮培养7～10 d后，以10%的接种量加入新鲜培养基进行第二代培养(以下各代均相同)，置旋转摇床上，温度(26±1)℃暗培养，120 r/min下进行悬浮培养。定期观察培养液内悬浮细胞或细胞团的生长变化，观测数据均为3次重复，建立悬浮细胞生长曲线。

以上所有实验如无特殊说明，均采用高压蒸汽灭菌法，温度控制在121～122℃，气压在103.421 kPa，灭菌30～40 min。

1.3 悬浮细胞生长的测定

采用500mL锥形瓶，装液量250mL，培养基为MS+NAA 0.3mg/mL，且初始 pH 值为5.8～6.0，接入20%接种量的白花蛇舌草细胞种子液，置旋转摇床上，培养温度(26±1)℃，120 r/min振荡暗培养20 d。培养结束后取细胞液40mL，4 000 r/min，离心20 min后倒尽上清液，称重，将收集的培养物置于60℃ 烘箱中烘干至恒重，作为干重，换算成每1 L培养基的细胞干重克数，表示细胞生长量。所有数据均为3次重复的平均值。

1.4 悬浮细胞培养液样品的制备

白花蛇舌草悬浮细胞以15%的接种量，用旋转式摇床以120 r/min、(26±1)℃进行悬浮培养，15 d后取培养液，10 000 r/min离心10 min后，取上清液备用。

1.5 接种量的测定

在添加了NAA 0.1mg/mL、蔗糖30 g/L且初始pH值为5.8～6.0的MS培养液中，分别接入10%，15%，20%，25%，30%接种量的白花蛇舌草细胞。在光照条件下培养15 d，培养结束后，在孔径0.4μm的滤网上减压抽滤后称其鲜重，然后将收集培养物置60℃ 烘箱中烘干至恒重，作为干重，换算成每天每升培养基增加的细胞干重克数，表示细胞生长速率。所有统计数据均为3次重复的平均值。

1.6 pH 测定

用精密pH计进行测定。

1.7 蔗糖含量测定

采用间苯二酚法，方法参见文献［7］。

以蔗糖为对照品，制备的标准曲线方程为:A=2.058 3 C －0.026 5，r=0.995 1，其中A 为在480 nm波长的吸光度值，C为蔗糖浓度(mg/L)，线性范围为0.024 4～0.544mg/L。

将细胞培养液样品适当稀释后，同法测定在480 nm波长的A值，依标准曲线算出各白花蛇舌草悬浮细胞培养液中蔗糖含量。

1.8 ［］含量的测定

方法见参考文献［7-8］。以硫酸铵为对照品，制备的标准曲线方程为:A=0.030 7 C －0.012 3，r=0.995 9，其中A为480 nm波长处的吸光度值，C为硫酸铵浓度(mg/L)。

将细胞培养液样品适当稀释后，同法测定在480 nm波长处的A值，依标准曲线算出各白花蛇舌草悬浮细胞培养液中硫酸铵含量。

1.9 ［］含量测定

方法见参考文献［7，9］。以硝酸钾为对照品，制备的标准曲线方程为:A=0.260 8 C+0.011 5，r=0.991 9，其中A为360 nm波长处的吸光度值，C为硝酸钾浓度(mg/L)。

将细胞培养液样品适当稀释后，同法测定在360 nm波长处的A值，依标准曲线算出各白花蛇舌草悬浮细胞培养液中［］含量。

1.10 多糖含量测定

采用苯酚硫酸法［10］。实际产生的多糖为总糖减去残余蔗糖的量。以葡萄糖为对照品，制备的标准曲线方程为:A=9.168 8 C+0.002 3，r=0.998 8，其中A为490 nm波长处的吸光度值，C为葡萄糖浓度(mg/L)。

将细胞培养液样品适当稀释后，同法测定在490 nm波长处的A值，依标准曲线算出各白花蛇舌草悬浮细胞培养液中多糖含量。

2 结果

2.1 接种量测定

由图1可以看出，当接种量达到15%时，细胞干重达到最大值，接种量继续增大，细胞干重会大幅降低，在接种量到25%之后，细胞干重变化不大。

图1 白花蛇舌草细胞悬浮培养液中不同接种量的细胞干重变化Fig.1 Effect of innocation amount in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

2.2 细胞生长的周期变化

由图2可以看出，当培养时间达到9 d时，细胞干重达到最大值，以后的培养时间内，细胞干重会略有减少。

图2 白花蛇舌草细胞悬浮培养液中细胞干重周期变化Fig.2 Changes of CDW in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

2.3 细胞培养液中营养物质的消耗变化

由图4可以看出，随培养时间的变化，pH很快减少，大约在9 d后就达到pH 3左右，说明在培养周期内，细胞液中大量产生酸，或有生理酸性盐被利用，但如果只是生理酸性盐被利用而引起的pH降低，则pH不会降低这么多，说明还是有酸性物质被生成。

培养液中的主要营养成分碳源——蔗糖，在培养开始时，有比较大的降低，在培养后期，细胞干重不再增加时，也不再有大的改变。

由图4可以看出，随培养时间的变化，多糖起先增加不是很多，随培养的进行，在培养后期，逐渐大量生成，说明它和细胞的生长属于非偶联型。图4中最终多糖的浓度为25 g/L，蔗糖的浓度18 g/L，两者之和为43 g/L，高于蔗糖的初始浓度30 g/L，这可能是因为培养液中含有的其它含碳物质也参与到了多糖的合成中。

图3 白花蛇舌草细胞悬浮培养液中［］和［］周期变化Fig.3 Change of［］in cell suspension culture of Hedyotic diffusa

图4 白花蛇舌草细胞悬浮培养液中pH和多糖周期变化Fig.4 Change of pH and polysaccharide sustain cell suspension culture of Hedyotic diffusa

3 讨论

在白花蛇舌草悬浮细胞培养时，最大的特点是，细胞大量繁殖，细胞浓度不断增大，细胞干重达到最大值，当培养时间达到9 d时，pH很快减少，达到3左右，以后的培养时间内，细胞生长减缓甚至停止，细胞出现衰老和凋亡，细胞干重会略有减少。说明在培养周期内，细胞液中大量生成酸性物质，致使细胞的生长受到抑制，这也被以后分离实验所证实。

在白花蛇舌草悬浮细胞培养时，培养液中的主要营养成分氮源［］说明它被细胞生长优先于［］利用，这和在一般的微生物培养中的规律不太一样。但因生酸，生长受到抑制，细胞干重增加的不多，所以减少的量有限。

培养液中的主要营养成分碳源——蔗糖，在培养开始时，有比较大的降低，在培养后期，细胞干重不再增加时，也不再有大的改变。细胞液中多糖的量，随培养时间的变化，多糖起先增加不是很多，随培养的进行，在培养后期，逐渐大量生成，说明它和细胞的生长属于非偶联型。

因白花蛇舌草悬浮细胞系生长迅速，极具工业化潜力，本研究结果可为以后的大规模培养提供理论与实验基础，为其产业化生产提供依据。

［1］吴厚铭，黄胜余，劳霞飞，等.白花蛇舌草免疫多糖结构的研究［J］.有机化学，1992，12:428-431.

［2］吕华冲，何 军.白花蛇舌草化学成分的研究［J］.天然产物研究与开发，1996，18(1):34-37.

［3］单保恩，张金艳，杜肖娜，等.白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性［J］.中国中西医结合杂志，2001，21(5):370-374.

［4］谭宁华，王双明.白花蛇舌草抗肿瘤活性和成分［J］.天然产物研究与开发，2002，4(5):33-36.

［5］巢建国，谈献和，张 瑜，等.白花蛇舌草组织培养研究［J］.南京中医药大学学报，2005，21(6):369-370.

［6］于瑞莲，巢建国，许金国.白花蛇舌草细胞悬浮培养的建立与条件优化［J］.海峡药学，2006，18(6):132-134.

［7］汤章城，魏家绵，陈 因，等.现代植物生理学实验指南［M］.北京:北京科学出版社，1999:99-101.

［8］马 悦，朱贻华，赵东玲，等.利用Berthelo颜色法测定发酵液中铵离子的干扰排除［J］.华东理工大学学报，2006，32(3):282-284.

［9］刘振民，姜 智.间苯二酚法快速测定水中硝酸盐氮的探讨［J］.环境与健康杂志，1988，5(5):27-28.

［10］张惟杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海:上海科技出版社，1987.