羟乙葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注氧化损伤的保护作用

余雪源，仲 英，左春旭，张岫美

(1.山东大学 医学院 药理学研究所，山东 济南 250012;2.山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062)

羟乙葛根素(hydroxyethylpuerarin，化合物 N-2035)是葛根素(puerarin)经结构修饰后得到的新型异黄酮类化合物，脂溶性增加，可以通过血脑屏障。我们以往的研究证明，羟乙葛根素具有减轻脑缺血再灌注损伤，提高脑的总抗氧化能力，抑制细胞凋亡，抗炎、抑制兴奋性氨基酸——谷氨酸的释放，保护低氧低糖损伤的大鼠皮层星形胶质细胞，保护过氧化氢损伤的脑血管内皮细胞，阻断β肾上腺素受体等作用［1-11］。本文以大鼠大脑中动脉阻塞制备缺血再灌注损伤模型，研究羟乙葛根素对再灌注损伤大鼠神经病学评分、脑梗死面积和清除超氧阴离子(·O－2)和羟自由基(·OH)能力的影响，探讨羟乙葛根素保护脑缺血再灌注损伤的作用及作用机制。

1 材料

1.1 仪器

TGL-16G型冷冻离心机和L8-80型低温超速离心机，美国 Beckman公司;尼龙栓线，自制;UV-2102PCS型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司。

1.2 药品与试剂

羟乙葛根素和葛根素，山东省医学科学院药物研究所;·OH测定试剂盒、·O－2测定试剂盒和蛋白定量(双缩脲法)测定试剂盒，南京建成生物研究所;氯化三苯四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)上海试剂三厂。

1.3 动物

健康雄性Wistar大鼠，体重275～325 g，由山东大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(鲁)20050017。

2 方法

2.1 动物分组

Wistar大鼠随机分为:①缺血再灌注组15只，水5mL/kg;②假手术组10只，水5mL/kg;③葛根素组15只，25mg/kg;④羟乙葛根素低剂量组15只，5mg/kg;⑤羟乙葛根素中剂量组15只，25mg/kg;⑥羟乙葛根素高剂量组15只，125mg/kg。分别于术前10 d灌胃给药，以后1次/d。每组选取其中成功制备局灶性脑缺血模型的10只大鼠进行实验。

2.2 模型制备

参考Zea Longa等的方法［12］并进行改进，制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤模型。大鼠经水合氯醛(300mg/kg，ip)麻醉后仰卧位，颈正中切口，钝性分离出左侧颈总动脉和颈外动脉，在颈外动脉发出约0.8 cm处结扎。在颈外动脉下方小心分离出颈内动脉。将一端已加热成圆珠状的尼龙渔线插入颈总动脉，经颈总动脉分叉处，并将预先放入颈总动脉根部的丝线敷紧，将尼龙渔线缓缓推入至大脑前动脉(约20 mm)再往回拉2 mm即至大脑中动脉口。缝合肌肉和皮肤。缺血1 h后，将尼龙渔线抽出使头端回到CCA处即可使动脉恢复再通，再灌24 h。手术过程中保持室温在25℃，维持大鼠的体温在37℃。假手术组大鼠只进行麻醉和血管分离术。

2.3 神经病学评分

模型大鼠清醒后可观察到同侧Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫，主要表现为右前肢内收，肩内旋，提尾悬空时，右前肢紧贴胸壁，行走时向右侧旋转，右侧肌张力下降。再灌注24 h后参照Longa方法［13］进行5分制行为评分。评分标准:无明显神经病学症状为0分;不能完全伸展右侧前抓为1分;身体向右侧旋转为2分;行走时向右侧倾倒为3分;不能自行行走为4分。满分为11分，积分越高，说明动物行为学障碍越明显。0和4分的动物弃之不用。

2.4 生化指标测定

缺血再灌注24 h后，处死大鼠，迅速取脑称重。用生理盐水制成10%脑组织匀浆，4℃，3 000 r/min离心10 min，取上清液即为10%脑组织匀浆。留取1mL低温10 000 r/min离心10 min，上清液即为胞浆，沉淀为线粒体。参照试剂盒说明书测定大鼠脑组织匀浆、胞浆和线粒体的·O－2和·OH水平。

2.5 梗死范围的测定

大鼠断头处死，迅速取左脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，沿冠状面切成约2 mm/片的脑片6片，放入3%TTC溶液3mL和1 mmol/L K2HPO4溶液0.1mL，避光，37℃温浴30 min。正常组织染色后呈红色，梗死部位呈白色。将切片用数码照相机拍摄后输入计算机，利用形态学分析系统电脑软件(江苏省捷达科技发展有限公司)进行计算:脑梗死面积(%)=梗死组织面积/脑总量×100%。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 神经生物学评分

结果见表1。缺血再灌注损伤组大鼠神经行为学评分显著高于假手术组(P＜0.01)，而葛根素和羟乙葛根素各剂量组大鼠神经行为学评分则显著低于缺血再灌注损伤组(P＜0.01)。

表1 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤24 h神经障碍评分的影响(n=10，±s)Tab.1 Effect of hydroxyethylpuerarin on neurological deficit score after 24 h middle cerebral artery reperfusion rats(n=10，±s)

表1 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤24 h神经障碍评分的影响(n=10，±s)Tab.1 Effect of hydroxyethylpuerarin on neurological deficit score after 24 h middle cerebral artery reperfusion rats(n=10，±s)

与假手术组比较:1 P＜0.01;与缺血再灌组比较:2 P＜0.011P＜0.01 vs sham group;2 P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

组 别 剂量/(mg/kg) 神经障碍评分/分假手术组 －0.61±0.06缺血再灌注组 － 3.11±0.291葛根素组 25 1.26±0.172羟乙葛根素低剂量组 5 1.31±0.252羟乙葛根素中剂量组 25 1.24±0.192羟乙葛根素高剂量组 125 1.18±0.242

3.2 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织清除·O－2能力的影响

见表2。与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠脑组织匀浆、胞浆和线粒体清除·O－2能力显著降低(P＜0.01)，而羟乙葛根素和葛根素组则显著提高(P＜0.05 或 P＜0.01)。

3.3 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织清除·OH能力的影响

表2 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织清除·能力的影响(n=10，±s)Tab.2 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering· in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

表2 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织清除·能力的影响(n=10，±s)Tab.2 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering· in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

葛根素组 25 43.64±9.45334.81±57.1945.97±9.95羟乙葛根素低剂量组 5 52.91±6.972 376.21±48.502 55.69±7.342羟乙葛根素中剂量组 25 44.31±8.403 337.85±55.912 51.83±9.823羟乙葛根素高剂量组 125 42.72±9.412 329.72±49.37 44.97±8.113

与假手术组比较:1P＜0.01;与缺血再灌组比较:2P＜0.05，3P＜0.01

1P＜0.01 vs sham;2P＜0.05，3P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

表3 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织清除·OH能力的影响(n=10，±s)Tab.3 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering ·OH in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

表3 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织清除·OH能力的影响(n=10，±s)Tab.3 Effects of hydroxyethylpuerarin on scavengering ·OH in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

与假手术组比较:1 P＜0.01;与缺血再灌组比较:2 P＜0.05，3 P＜0.011 P＜0.01 vs sham;2 P＜0.05，3 P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

葛根素组羟乙葛根素低剂量组 5 9.77±3.353 33.74±10.773 10.12±3.473羟乙葛根素中剂量组 25 11.95±4.112 34.37±11.763 14.31±4.922羟乙葛根素高剂量组 125 10.89±2.572 38.97±11.572 11.28±2.663

见表3。与假手术组相比，缺血再灌注损伤组大鼠脑组织匀浆、胞浆和线粒体清除·OH能力降低(P＜0.01);羟乙葛根素和葛根素均可显著提高脑组织匀浆、胞浆和线粒体清除·OH的能力(P＜0.05，P＜0.01)。

3.4 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织梗死面积的影响

见表4。与假手术组相比，缺血再灌注损伤大鼠脑梗死面积明显增加(P＜0.01)。与缺血再灌注损伤组相比，羟乙葛根素和葛根素均可使脑梗死面积显著缩小(P＜0.01)。

表4 羟乙葛根素对大鼠缺血再灌注损伤脑组织梗死面积的影响(n=10，±s)Tab.4 Effects of hydroxyethylpuerarin on infarction area in focal brain injury rats induced by ischemia reperfusion(n=10，±s)

与假手术组比较:1 P＜0.01;与缺血再灌组比较:2P＜0.011P＜0.01 vs sham;2 P＜0.01 vs ischemia reperfusion group

组 别 剂量/(mg/kg) 梗死面积/%假手术组 －0±0缺血再灌组 － 37±111葛根素组 25 18±92羟乙葛根素低剂量组 5 19±62羟乙葛根素中剂量组 25 27±82羟乙葛根素高剂量组 125 20±62

4 讨论

缺血性脑血管病是严重危害人类健康的常见病，其发病率、致残率和死亡率均较高，已成为人类主要死亡原因之一。近年日益增多的证据表明，在缺血性脑血管病损伤的病理过程中，氧自由基的产生是一个关键的环节。缺血再灌注对脑血管产生危害作用的氧自由基主要是·和·OH。氧自由基在体内的变化，可直接反映脂质过氧化的水平活性高低。根据Haber-Weiss反应以及在游离Fe2+的存在的条件下，·更容易歧化成H2O2，根据Fenton反应，H2O2能生成比·更具活性与毒性的·OH。本实验模拟体内产主大量自由基的组织，进一步观察组织清除·OH和·的能力。

与缺血再灌注损伤组相比，羟乙葛根素和葛根素可以显著提高机体清除·OH和·的能力，且羟乙葛根素的作用强于葛根素，说明羟乙葛根素可能通过清除氧自由基对缺血再灌注损伤产生保护作用。

TTC是脑组织缺血性损伤的标记物。TTC受氢后形成红色，能使正常组织染成深红色，而缺血组织则无颜色反应［14］，因此，能清晰地显示缺血组织的范围和边界，特点是简便快速、重复性好、稳定性强，目前已被广泛用于标记脑梗死面积。本实验病理形态学观察，TTC染色用药组大鼠脑组织坏死灶比缺血再灌注损伤模型大鼠明显轻，梗死区面积也低于损伤模型组大鼠，说明羟乙葛根素有增加局部组织血流量，促进神经功能的恢复。本实验中缺血灶的位置和范围与大脑中动脉供应区一致，显示局灶性大鼠脑缺血损伤模型制备成功。

为探讨羟乙葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用的量效关系，我们在的过去使用剂量的基础上，设计了5，25和125mg/kg三个剂量组。研究结果显示，除大鼠的神经行为学评分以及清除·能力有剂量依赖性的趋势外，对大鼠脑梗死面积的缩小和清除·OH能力则剂量依赖关系不明显，提示整体动物实验，应当进一步观察较低剂量羟乙葛根素的反应，以期找到合适的剂量，为临床研究提供实验依据。

本实验证明，羟乙葛根素改善缺血再灌注损伤大鼠的神经行为学评分，缺血再灌注损伤脑梗死面积，提高缺血大鼠脑组织清除氧自由基的能力，提示羟乙葛根素对局灶性脑缺血损伤具有保护作用，该作用可能与其清除·和·OH，发挥抗氧化作用有关。脑缺血再灌损伤的病理生理学机制复杂，羟乙葛根素保护再灌注脑损伤的作用机制需进一步探讨。

［1］王姿颖，张岫美，魏欣冰，等.化合物N-2035对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织损伤的保护作用——抗氧化活性［J］.山东大学学报:医学版，2003，41(1):36-38.

［2］孙 茹，张岫美，魏欣冰，等.化合物N-2035对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑组织损伤的保护作用——抗细胞凋亡作用［J］.山东大学学报:医学版，2003，41(3):249-252.

［3］光红梅，张岫美，李应全，等.化合物N-2035对过氧化氢致牛脑微血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.中国药学杂志，2008，43(13):982-986.

［4］Guang Hongmei，Zhang Xiumei，Li Yingquan，etal.Protective effects of compound N-2035 on bovine cerebral microvascular endothelial cells damages induced by hydrogen peroxide in culture［J］.Acta Pharm Sin，2005，40(3):220-224.

［5］孙 茹，王 欣，魏欣冰，等.羟乙葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及p53表达的影响［J］.中国生化药物杂志，2004，25(6):336-338.

［6］王姿颖，张岫美，魏欣冰，等.羟乙葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤NO水平和NOS活性的影响［J］.中国药学杂志，2006，41(2):112-114.

［7］Lou Haiyan，Zhang Xiumei，Wei Xinbing，etal.Anti-inflammatory effect of hydroxyethylpuerarin on focal brain ischemia/reperfusion injury in rats［J］.Chin JPhysiol，2004，47(4):203-207.

［8］张 斌，张岫美，魏欣冰，等.羟乙葛根素对脑星形胶质细胞氧化性损伤的保护作用［J］.药学学报，2006，41(2):171-174.

［9］王姿颖，魏欣冰，张 斌，等.羟乙葛根素降低大鼠脑缺血再灌注损伤内皮素-1和白细胞介素-6的水平［J］.中国生化药物杂志，2006，27(5):280-282.

［10］娄海燕，魏欣冰，王汝霞，等.羟乙葛根素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织ICAM-1及VCAM-1表达的影响［J］.中国药学杂志，2008，43(2):104-107.

［11］潘 燕，徐红岩，张岫美.羟乙葛根素对β肾上腺素受体的阻断作用［J］.中国生化药物杂志，2006，27(3):145-147.

［12］Enrique Z L，Philip P W，Sara C，etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84-91.

［13］Packer L，Taber M G，Xin W.Proceeding of international symposium on natural antioxidants molecular mechanisms and health effects［M］.Illinois:AOCSpress champaign，1995:44-47.

［14］Lundy E F.Morphometric evaluation of infarct in rat and gerbis［J］.JPharmacol Method，1986，16:201-203.